燕麦组织培养和农杆菌介导的燕麦遗传转化体系的建立

“白燕10号”裸燕麦是吉林省白城市农科院2000年从加拿大引入的杂交组合品种的F3代材料经系谱法选育而成。燕麦是抗逆性较强的作物，建立燕麦高效的组织培养和遗传转化体系对于燕麦抗性基因的研究和利用，以及燕麦品种改良具有重要意义。本研究建立了“白燕10号”裸燕麦稳定高效的组织培养和植株再生体系，建立了农杆菌介导的燕麦遗传转化体系，对今后以“白燕10号”等“白燕”系列品种为材料的燕麦遗传转化研究奠定了基础。主要研究结果如下：1.“白燕10号”裸燕麦稳定高效的组织培养和植株再生体系的建立(1)通过比较种子、成熟胚、叶基切段和顶端分生组织的愈伤组织诱导率和分化率,确定了成熟胚为最适外植体。(2)筛选出了诱导白燕10号愈伤组织的最佳培养基：MS+2，4-D0.5mg/L+NAA0.1mg/L。(3)利用正交实验设计,优化出诱导分化的培养基：MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.4mg/L+IAA0.4mg/L。2．“白燕10号”裸燕麦遗传转化体系的建立(1)通过愈伤组织对潮霉素敏感性试验确定了转化中使用选择剂潮霉素的合适剂量为20-30mg/L；农杆菌EHA105对头孢霉素和羧苄青霉素的敏感性试验结果表明：羧苄青霉素更适合作为转化过程中的抑菌剂，最适浓度为200-400mg/L；(2)分别用不同浓度的农杆菌菌液侵染愈伤组织，确定了农杆菌菌液OD600=0.5-0.8为最适侵染浓度，侵染10min左右最利于愈伤组织分化。(3)遗传转化：带有GFP基因的质粒pCAMBIA1304-GFP转化农杆菌EHA105，然后用OD600=0.5的菌体悬浮液侵染诱导一个月左右的燕麦愈伤组织10min，共培养3d后接到筛选培养基上。共培养培养基上添加200umol/L的乙酰丁香酮，每十天继代一次，继代培养基与筛选培养基相同。筛选培养基中添加25mg/L的潮霉素和350mg/L的羧苄青霉素。选择继代1-2次的愈伤组织进行分化，待再生苗长到3-4cm时接到生根培养基上，最后练苗、移栽。(4)转基因燕麦的检测：由于质粒中带有GFP基因，将转化后的愈伤组织做成切片在荧光显微镜下观察，观测到绿色荧光现象，初步证明质粒已经整合到燕麦基因组中；共获得了132株再生转化植株，用PCR检测，其中有78株PCR阳性植株，PCR阳性率为59.1%。提取部分PCR阳性植株的总RNA进行RT-PCR检测均呈阳性。