单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)简称单增李斯特,它是一种能够引起人畜共患的食源性致病菌,属李斯特菌属。它在自然界中分布广泛,如土壤、腐败的蔬菜及多种食品中。食用了被单增李斯特污染的食物后可以引起“李氏杆菌病”,使人和动物患脑膜炎、败血症、流产等,死亡率可达20%～30%。传统的检测单增李斯特的方法操作繁琐、检测时间较长,通常需要5～7 d才能完成且灵敏度较低。因此需要建立快速、灵敏的单增李斯特的检验方法。荧光定量PCR技术已经成为针对食源性致病菌的一种常规的分子检测方法,广泛应用于食品检测中,灵敏度好检出率高,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。本试验利用荧光定量与锁定寡核苷酸相结合的方法快速检测单核增生性李斯特氏菌。试验中我们选取hlyA基因作为靶基因,但针对这个基因我们发现其片段的GC含量非常低,通常在40%以下,这就造成不能设计出合适的引物和探针,从而造成信号收集效果差,试验灵敏度低,影响检出率。为了克服这个问题,我们采取荧光定量PCR检测手段和锁定寡核苷酸(LNA)相结合的方法进行检测。锁定核苷酸是双核酸结构,在试验中可以增强寡核苷酸的亲和力和检测的特异性,并且加强寡核苷酸链的稳定性和碱基堆积力,从而提高试验的准确性和灵敏度。本研究利用专业软件设计出合适的特异性引物和探针,经过普通PCR扩增后,获得119 bp产物并将PCR产物进行2 %的琼脂糖凝胶电泳,产物胶回收纯化后连接到pUC119载体上,并转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,对阳性克隆进行了筛选鉴定,构建了目的重组质粒,作为标准品绘制标准曲线。并对插入的外源基因进行了测序,与文献报道的序列相似性达到100%,从而证实PCR扩增产物确为目的扩增产物。构建的重组质粒可以得到较好的扩增曲线和Ct值。试验中对比三种从猪肉中提取单增李斯特的方法,确定优选,还利用普通PCR确定引物特异性良好。对PCR反应体系中退火温度、引物探针配比等进行了优化,以确定适宜PCR反应体系和PCR扩增程序。适宜反应体系为:12.5μL Premix Ex Taq (2×),上、下游引物(各10μM)各0.5μL,1μL目的探针(3μM),2μL模板,8.5μL灭菌双蒸水,总反应体系25μL;适宜扩增程序为:95℃预变性10 S,再按94℃5 S-60℃30 S进行45个循环。本方法纯菌培养物检测灵敏度可以达到30 copies/μL,1.2×10 cfu/mL;人工污染猪肉检出限可以达到48 copies/μL,3.2×102 cfu/ mL,并且使检测可以在1个工作日内完成,大大缩短了检测时间。
