TLR2基因在新生血管形成中的作用

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实验背景:冠状动脉粥样硬化性心脏病已成为导致我国人民死亡的重要原因,尽管介入治疗及药物治疗已经有了长足发展,其发病率仍呈上升趋势。动脉粥样硬化是冠状动脉粥样硬化性心脏病发展病程的重要病理生理改变,动脉粥样硬化发生可以累及包括冠状动脉、颅内动脉、下肢动脉在内的全身动脉系统,当出现血栓、栓塞和各种原因引起的动脉急性闭塞时可导致供血组织缺血,发病突然,进展迅速,导致组织器官缺血坏死甚至危及生命。而目前主要的治疗方法是血运重建术和溶栓治疗。对于一些冠状动脉多支弥漫性病变,及介入治疗后冠状动脉再狭窄的患者来说,这两种治疗方法难以取得显著的效果,同时两种治疗方法均有不容忽视的并发症及禁忌症,因此有必要探索新的治疗方法。在组织缺血损伤的情况下能够逐渐建立起自身的侧枝循环,以适应或抵御局部的缺血缺氧。侧枝循环的建立可以减少缺血面积,改善功能,提高闭塞病人的存活率。但自身的血管再生过程十分缓慢,无法适应缺血组织的需要。因此需要人为的增加促血管生成因子而促进新生血管的生成,称为“治疗性血管再生”(therapeutic angiogenesis)。TLRs(toll-like receptor)受体是一类跨细胞膜的结构识别受体家族,在机体炎症、免疫反应和肿瘤发生中发挥重要作用。而TLR2是TLR受体中重要成员,其编码基因定位于4号染色体4q32区,主要在外周血白细胞表面表达,可以通过与细菌和内源性配基相互作用,从而激活转录因子,如NF-κB和AP-1。目前研究表明,在组织发生缺血损伤后,器官内可出现大量的凋亡细胞,机体可产生宿主防御及损伤修复反应等一系列免疫反应,而炎症因子的释放及炎症细胞的聚集对组织损伤及血管再生至关重要。TLR2缺失可导致在肾脏缺血再灌注中肾脏损伤、白细胞流入、肾小管损伤受到抑制。在体外实验中,当心肌细胞发生氧化应激反应时,抑制TLR2可以阻断NF-κB和AP-1的核转运。TLR2在肌肉缺血再灌注损伤的恢复中扮演重要角色。TLR2信号通路的激活可以促进血管新生在多种疾病中被报道。但TLR2与血管再生的研究主要集中在肿瘤的发生和发展,如幽门螺旋杆菌通过TLR2来激活MAPK级联反应,从而导致COX-2依赖性的前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)释放,最终引起癌症细胞侵入和血管新生。TLR2信号通路与血管新生的密切关系是否与组织缺血损伤后的损伤和功能恢复有关尚待明确。而既往在TLR2基因与冠心病病人的研究主要集中在TLR2在动脉粥样斑块的巨噬细胞表面的表达水平增高,与体内炎症水平和动脉粥样硬化的进展密切相关,TLR2在不稳定性心绞痛病人的外周血单核细胞表面表达显著上升。对于冠心病病人缺血心肌侧枝循环情况与TLR2的表达之间的关系目前尚无相关研究。实验目的:本研究以TLR2基因敲除小鼠(TLR2-/-)(C57BL/6种系)和野生型(WT)C57BL/6小鼠为实验对象,观察TLR2基因在小鼠急性下肢缺血模型中对组织缺血坏死的作用,以及该信号通路在缺血坏死后的恢复期中对血管新生作用的效应。本研究观察冠心病患者中血清TLR2在的表达水平以及与侧枝循环血管之间的关系。实验方法:体外实验中,以脐静脉内皮细胞(HUVECs)为研究对象,采用划痕实验判断TLR2激动剂Pam3CSK4对内皮细胞迁移能力的影响;分离小鼠淋巴细胞种于HUVECs上,经Transwell实验分析Pam3CSK4对HUVECs通透性的影响。体内实验中,取WT和TLR2-/-小鼠(体重在18-25g之间)经4%水合氯醛腹腔注射麻醉后,于体视显微镜下结扎左侧股动脉近段、远端及其主要分支,右侧股动脉作假手术处理,仅分离股动静脉而不结扎。术后第1,3,7,14天对小鼠下肢缺血损伤进行半定量评估(0分:没有改变;1分:轻度肤色改变;2分:中到重度肤色改变;3分:坏死;4分:自发截肢。每组8只)及缺血肢体功能半定量评估(0=脚趾弯曲;1=足底弯曲;2=足底不能弯曲,但无拖拉肢体;3=拖拉肢体)。术前及术后第1,3,7和14天小鼠经4%水合氯醛腹腔注射麻醉后用激光多普勒灌注成像系统测量双侧下肢血流灌注值。为探讨TLR2基因敲除对缺血后血管新生的影响机制,术前及术后1,3,7和14天两组各处死等量小鼠,取等量内收肌提取蛋白标本行Western Blot测定血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达,取腓肠肌标本免疫组化染色CD31,CD31标记小血管数。各小鼠处死前眼眶取血,置于抗凝管中,高速离心后取血清,ELISA法测定TNF-a,IL-6表达。另外,TLR2-/-小鼠和WT小鼠各6只,分别心脏取血,分离淋巴细胞,行transwell观察两组小鼠来源淋巴细胞跨人脐静脉内皮细胞迁徙率的差异。在临床试验中,选择87名于本院心内科住院并行冠脉造影的患者,根据冠脉造影结果及Rentrop评分分为造影正常组,侧支循环较差组和侧性循环较好组3组,所有患者在行冠脉造影前静脉抽血留取血清样本,通过ELISA方法检测血清中TLR2表达量的情况。实验结果:体外实验中,Pam3CSK4处理组内皮细胞迁移能力明显增强,Pam3CSK4预处理HUVECs后,跨HUVECs的淋巴细胞的数量与对照组比较明显增加(102.29±10.60/20X高倍视野和68.69±10.57/20X高倍视野,P<0.001)。在体内实验中,术后WT组小鼠缺血下肢功能在第3天基本恢复,而TLR2-/-组小鼠直到第7天以后才消失,术后第1,3,7天TLR2-/-组缺血肢体功能评分显著高于WT组(分别为1.88±0.92和1.10±0.85,P=0.011;1.54±0.88和0.81±0.83,P=0.031;1.56±0.53和0.67±0.77,P=0.008)。术后7,14天TLR2-/-组缺血下肢血流灌注值显著低于WT组(分别为39.15±3.71和52.40±2.93,P=0.001;33.47±1.69和47.43±4.27,P=0.013),然而术后1,3天,两组间的缺血下肢血流灌注值差别无统计学意义(24.05±6.69和26.50±9.16,P>0.05;38.144±8.82和39.61±9.45,P>0.05)。术后7,14天CD31免疫组化提示两组间新生小血管数TLR2-/-组显著低于WT组(分别为7.63±1.41/40X高倍视野和14.17±4.07/40X高倍视野,P=0.001;7.444±1.423/40X高倍视野和13.67±2.92/40X高倍视野,P<0.001),提示TLR2-/-小鼠缺血后小血管新生受损。Western blot提示TLR2/-小鼠VEGF表达水平较WT小鼠低,且增加幅度缓慢。ELISA法小鼠外周血提示,TLR2-/-组小鼠不同时期IL-6表达量均显著低于WT组小鼠(分别为5.85±0.94ng/ml和11.79±5.80ng/ml,P=0.043;5.80±0.80ng/ml和18.91±7.03ng/ml,P=0.021;5.60±2.39ng/ml和19.95±10.81ng/ml,P=0.003;4.68±0.57ng/ml和13.68±7.80ng/ml, P=0.002);TLR2-/-组小鼠第1,7,14天TNF-α表达量均显著低于WT组小鼠(分别为15.18±5.09ng/ml和50.80±25.97ng/ml,P=0.021;27.35±9.44ng/ml和44.04±9.68ng/ml, P=0.005;35.69±15.16ng/ml和55.74±20.08ng/ml, P=0.046)。测TLR2-/-小鼠和WT小鼠外周血分别提取淋巴细胞行transwell跨人脐静脉内皮细胞迁徙实验,发现TLR2-/-小鼠淋巴细胞跨内皮细胞迁移能力较正常WT小鼠下降(60.92±12.27/20X高倍视野和145.07±14.49/20X高倍视野,P<0.001)。在临床研究中,患者血清标本检测TLR2水平提示三组间含量无显著性差别(分别为1380.1±891.36pg/ml,1033.9±860.57pg/ml,1433.8±805.75pg/ml,P>0.05),但Rentrop评分为3分组患者血清TLR2表达水平明显较其他组高(分别为1111.0±848.13pg/ml,1239.8±984.44pg/ml,1103.7±483.62pg/ml,2154.8±837.16pg/ml,p<0.01),回归分析提示TLR2同侧支评分间显著相关(p<0.05)。实验结论:1、TLR2激动剂促进了HUVECs内皮细胞迁移能力,增加了HUVECs对于淋巴细胞的通透性。2、经单侧股动脉结扎术建立小鼠急性下肢缺血模型后,与野生型C57BL/6小鼠相比较,TLR2-/-组小鼠术后缺血肢体功能恢复速度较慢。这与TLR2-/-小鼠在急性下肢缺血后缺血部位侧枝血管的数量显著少于野生型C57BL/6小鼠相关。3、TLR2基因敲除小鼠缺血损伤部位的血管新生数量减少可能与血清炎症因子TNF-α,IL-6表达水平较低,缺血部位VEGF浓度较低,及外周血淋巴细胞的穿透能力下降有关。4、冠心病患者血清中TLR2表达水平与冠脉侧支循环建立程度明显相关,并且TLR2表达水平的作用独立于年龄,糖尿病,体重指数,心功能,血脂水平等危险因素而单独存在。
致谢第5-6页
中文摘要第6-11页
Abstract第11-15页
缩略语第16-18页
目次第18-19页
序言第19-21页
第一部分 TLR2基因缺失对小鼠下肢急性缺血后血管新生的影响第21-67页
    1.1 前言第21-22页
    1.2 材料和方法第22-40页
    1.3 结果第40-56页
    1.4 讨论第56-62页
    1.5 小结第62-63页
    1.6 参考文献第63-67页
第二部分 TLR2在冠心病患者体内表达改变及与血管再生的关系第67-85页
    2.1 引言第67-68页
    2.2 材料与方法第68-72页
    2.3 实验结果第72-77页
    2.4 讨论第77-80页
    2.5 结论第80-81页
    2.6 参考文献第81-85页
综述第85-123页
    参考文献第106-123页
作者简历第123页
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