X射线辐照后对中枢海马组织损伤作用研究

目的：构建ICR小鼠X射线全脑辐照模型和离体海马神经元辐照模型，研究不同剂量X射线照射后不同时间点中枢海马齿状回的病理损伤，及其对神经元超微结构的损伤作用、细胞凋亡、DNA双链断裂、NBS1、ATM、P53、PUMA等DNA损伤修复相关蛋白表达以及细胞周期改变等情况的影响，探讨X射线对中枢海马齿状回神经的损伤及其机制，为辐射防护提供理论依据。方法：健康ICR小鼠80只，体重18~22g，雌雄各半。随机分为五组（四个不同剂量X射线照射组和一个空白对照组），X射线照射组小鼠麻醉后分别接受0.4Gy、4Gy、10Gy、18GyX射线全脑一次照射，空白对照组小鼠麻醉后作假照射（不予X射线照射）。X射线辐照后4h、12h、24h、48h取小鼠全脑对中枢海马组织进行检测（同一剂量X射线照射后每时间点动物数为4只）。运用HE染色检测颗粒细胞病理损伤，透射电镜从形态学上观察中枢海马齿状回颗粒细胞超微结构损伤，原位末端标记（TUNEL）法检测海马神经细胞凋亡，单细胞凝胶电泳（SCGE）和γ-H2AX细胞免疫荧光法检测中枢海马细胞DNA双链断裂，免疫组化和免疫蛋白印迹法检测中枢海马组织NBS1、ATM、P53、PUMA蛋白表达，流式细胞仪检测中枢海马细胞周期改变情况。结果经统计学处理，分析不同剂量X射线照射后不同时间，中枢海马组织的损伤、NBS1、ATM、P53、PUMA蛋白表达以及细胞周期改变之间的辐射效应关系。结果：（1）病理结果显示，对照组齿状回颗粒细胞和亚颗粒细胞结构紧密，形态完整、排列整齐，层次清晰，细胞核饱满、核仁清晰，无胶质细胞的浸润。在0.4Gy4h和12h点，齿状回颗粒细胞与对照组相似；照射组病理损伤随时间的延长呈递进性加重，剂量较大组光镜下可见齿状回颗粒细胞排列稀疏、紊乱，胞膜皱褶，核碎裂。（2）电镜结果显示，空白对照组中枢海马细胞内线粒体、内质网等细胞器未见明显异常，神经元形态正常，核膜完整，染色质未见浓染。与对照组海马齿状回颗粒细胞相比较，0.4Gy组照射后各个时间点齿状回颗粒细胞形态无明显改变，偶见齿状回颗粒细胞形态发生不规则改变，颗粒细胞核内染色质稍浓。4Gy组照射后4h观察到海马齿状回颗粒细胞形态不规则改变，在12h出现局部核膜断裂，24h和48h出现明显的线粒体肿胀变性。10Gy组照射后4h与12h观察到海马细胞固缩，核型变小，24h点核膜断裂明显，48h点细胞核有破裂症状。18Gy组照射后4h与12h海马细胞比10Gy剂量组中相同时间点固缩更加明显，48h表现更为严重，有坏死细胞出现。（3）单细胞凝胶电泳(SCGE)结果显示，不同剂量X射线照射后，各组随时间延长均出现DNA损伤，表现出在4h上升、12h或24h达到高峰、24h或48hDNA损伤参数逐渐下降的趋势；各剂量组间，DNA损伤随剂量的增加逐渐加重。（4）不同剂量X射线照射后不同时间点均可诱发海马神经元产生不同程度DSBs。同一照射剂量组中，γ-H2AX焦点数和阳性率均表现为在0.5h内迅速升高，1h达到高峰，4~48h逐渐下降；不同剂量组间，相同时间点γ-H2AX阳性率，均随剂量增加而加重。（5）细胞凋亡检测结果显示，与对照组相比，辐照组在电离辐射后各时间点海马齿状回细胞凋亡数均明显增多（除0.4Gy组）；细胞凋亡率随照射剂量增加而增加，并随时间的延长逐渐增加。0.4Gy组细胞凋亡率4-24h较对照组均略增高，但在48h有所回落；18Gy48h细胞凋亡率急剧降低。（6）免疫组化结果显示，X射线照射组在辐照后各个时间点中枢海马NBS1、ATM、P53阳性细胞数高于对照组，ATM、P53阳性细胞率随照射剂量增加而升高。在0.4~4Gy剂量组，随着照射后时间的延长，NBS1蛋白的表达先升高后降低，在10Gy剂量组NBS1蛋白的表达持续升高。（7） Western-blot结果显示，除18Gy48h的ATM、P53、PUMA蛋白表达较18Gy24h回落外，其余各组ATM、P53、PUMA蛋白表达均随着照射剂量的增加以及时间的延长而增加。照射后同一时间点，NBS1表达随着照射剂量增大，表达随之增高；在0.4~4Gy剂量组，随着照射后时间的延长，NBS1蛋白的表达先升高后降低，在10Gy剂量组NBS1蛋白的表达持续升高。（8）细胞周期结果显示，同一时间点各剂量组剂量组S期细胞明显增多，4Gy、10Gy、18Gy剂量组G2/M期细胞随着剂量的增大细胞数逐渐增多。结论：（1）0.4Gy、4Gy、10Gy、18GyX射线全脑辐照后4h、12h、24h、48h不同时间点均可诱发齿状回颗粒细胞不同程度病理损伤。0.4Gy剂量4h和12h点，齿状回颗粒细胞与对照组相似；其余实验组病理损伤随时间的延长呈递进性加重，呈现剂量-效应关系。（2）0.4Gy、4Gy、10Gy、18GyX射线全脑辐照后4h、12h、24h、48h不同时间点可见齿状回颗粒细胞有不同程度的超微结构损伤。即使较小剂量0.4Gy照射后，中枢海马也存在轻微染色质深染；随着照射剂量的增加，损伤逐渐加重，呈现剂量-时间-效应关系。（3）0.4Gy、4Gy、10Gy、18GyX射线全脑辐照后4h、12h、24h、48h不同时间点均可诱发齿状回颗粒细胞不同程度DNA损伤。同一照射剂量组中，DNA损伤先升高，12h或24h达到高峰，随后24h或48h逐渐下降，呈现时间-效应关系；不同剂量组间，相同时间点DNA损伤，均随剂量增加而加重，呈现剂量-效应关系。（4）不同剂量X射线照射后不同时间点均可诱发海马神经元产生不同程度DSBs。同一照射剂量组中，γ-H2AX焦点数和阳性率均表现为在0.5h内迅速升高，1h达到高峰，随后4~48h逐渐下降，呈现时间-效应关系；不同剂量组间，相同时间点γ-H2AX阳性率，均随剂量增加而加重，呈现剂量-效应关系。（5） X射线照射能够诱导中枢海马组织发生细胞凋亡，细胞凋亡率随照射剂量增加以及时间的延长而逐渐增加，呈剂量－时间－效应关系。（6）0.4Gy、4Gy、10Gy、18GyX射线全脑辐照后4h、12h、24h、48h不同时间点中枢海马NBS1、ATM、P53、PUMA蛋白表达均随着剂量的增加而升高，呈现剂量-时间-效应关系，且和DNA损伤的改变有相关关系，提示NBS1、ATM、P53、PUMA蛋白可能参与了DNA的识别和修复过程。（7）不同剂量X射线辐照后不同时间能够引起不同程度中枢海马细胞周期S期、G2/M期发生阻滞，与照射剂量、照射后时间相关。此外，细胞周期的改变与ATM、P53蛋白的表达改变相关联，提示ATM、P53蛋白可能是细胞周期的中枢调控枢纽。（8）不同剂量X射线与海马齿状回颗粒细胞应答之间存在着辐射剂量-时间-效应关系。一定剂量X射线照射后，海马齿状回颗粒细胞能够在较短时间内对X射线产生的损伤进行识别、修复等应答，推测其在海马学习记忆功能中起着重要作用。