ROS依赖的内质网应激—自噬反应在醉茄素A诱导人胰腺癌细胞凋亡中的作用研究

胰腺癌论文 醉茄素A论文 细胞周期论文 细胞凋亡论文 活性氧论文 细胞自噬论文 自噬抑制剂论文 RN
论文详情
目的研究醉茄的活性成分醉茄素A(withaferin A,WA)对人胰腺癌细胞增殖、凋亡等的影响及其可能的作用机制。方法采用CCK-8法检测细胞增殖活性;倒置显微镜观察WA对细胞形态的影响;Hoechst33258荧光染色和Annexin V–FITC/PI双标流式细胞术检测细胞凋亡;JC-1荧光探针检测细胞线粒体膜电位;PI染色流式细胞术检测细胞周期;Western Blot检测凋亡相关蛋白的变化;CM-H2DCFDA荧光探针标记检测细胞内活性氧(Reactiveoxygen species, ROS)水平;最后使用泛Caspase家族激酶抑制剂Z-VAD-FMK和各种抗氧化剂干预细胞后,观察细胞凋亡的变化。结果WA在体外对多种人胰腺癌细胞株均有一定的增殖抑制和凋亡诱导作用,且这种作用呈浓度和时间依赖性,但其对人正常细胞株的增殖抑制作用较小;WA可诱导人胰腺癌细胞线粒体膜电位下降,并阻滞细胞周期于G2/M期;Western Blot结果显示,WA能引起Caspase-3、Caspase-9、PARP1的剪切激活和Bax/Bcl-2比值上调;而Z-VAD-FMK可部分逆转WA所诱导的细胞凋亡效应;同时WA还可显著增加细胞内的ROS水平,但当使用抗氧化剂NAC和Catalase清除细胞内ROS后,细胞凋亡率也明显减少。结论WA在体外可显著抑制人胰腺癌细胞增殖,并阻滞细胞周期于G2/M期;WA能够诱导细胞发生凋亡,且这种凋亡依赖于Caspase家族的激活;另外,WA还可引起细胞内ROS水平显著增加,而WA诱导的细胞凋亡依赖于这种ROS的产生。目的通过体内外实验研究WA是否诱导人胰腺癌细胞发生自噬及其生物学意义。方法采用透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化。Western Blot检测自噬关键蛋白LC3B的表达情况。构建pEGFP-LC3质粒稳定转染细胞株,激光共聚焦显微镜观察细胞内绿色GFP-LC3点状阳性细胞数比例。利用溶酶体探针LysoTracker Red DND-99检测GFP-LC3与溶酶体之间的空间定位关系。采用多种自噬抑制剂及RNAi技术沉默自噬关键基因Atg5后检测细胞增殖和凋亡的变化。最后通过建立Panc-1裸鼠皮下移植瘤模型,在动物水平观察单用WA或联合使用自噬阻滞剂氯喹(chloroquine, CQ)后对胰腺癌细胞血管生成、增殖、凋亡和自噬等生物学特性的影响。结果透射电镜结果显示,WA作用后细胞质中可见大量空泡化双层膜结构及自噬体形成;Western Blot结果显示,WA可诱导自噬关键蛋白LC3B-Ⅱ的表达增加;激光共聚焦结果显示,WA可诱导稳定转染pEGFP-LC3质粒的细胞出现大量GFP-LC3点状聚集,并且这种绿色GFP-LC3与红色LysoTracker Red共定位;使用自噬溶酶体抑制剂与WA联合作用后,细胞内绿色GFP-LC3点状聚集进一步增多,且Western Blot显示LC3B-Ⅱ的表达也进一步增加;但另一种自噬阻滞剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)以及泛Caspase家族激酶抑制剂Z-VAD-FMK却对WA诱导的LC3B-Ⅱ的表达无显著影响;而当自噬溶酶体抑制剂与WA联用后可增强其抑制细胞增殖和诱导凋亡的效应;同样,当使用RNAi技术沉默自噬关键基因Atg5来抑制自噬后,可显著增加WA诱导的细胞凋亡;裸鼠皮下移植瘤模型结果显示:药物干预21天后,单用WA组的肿瘤体积和重量与对照组相比均有一定程度的减小(P<0.05);而当联合使用自噬阻滞剂CQ后,肿瘤体积和重量均较单用WA组进一步减小(p<0.05);免疫组化结果显示,单用WA组移植瘤组织血管标记蛋白CD34和肿瘤增殖抗原Ki67的表达较对照组均有一定程度的减少,而自噬相关蛋白p62/SQSTM1和LC3B的表达均明显增加(P<0.05);当联合使用CQ后CD34和Ki67的表达较单用WA组进一步下降(p<0.05),而p62/SQSTM1和LC3B的表达则进一步增加(P<0.05);Tunel检测显示单用WA组较空白对照组细胞凋亡率升高(P<0.05),而联合使用CQ后细胞凋亡率进一步增加(P<0.05)。结论WA在体内、体外均可诱导人胰腺癌细胞发生自噬,且自噬可能是作为一种保护性应激反应来对抗细胞凋亡;WA诱导的细胞自噬不能被Caspase家族激酶抑制剂Z-VAD-FMK所阻滞,且不依赖于Class Ⅲ PI3K通路;单用WA可部分抑制裸鼠皮下移植瘤生长,而联合自噬阻滞剂CQ后可显著抑制移植瘤生长并促进其凋亡。目的探讨内质网应激反应对WA诱导胰腺癌细胞凋亡和自噬的影响及其分子机制。方法采用Western Blot检测相关蛋白的变化;观察抑制mTOR通路后对WA诱导的细胞凋亡和自噬的影响;采用间接免疫荧光法和透射电镜观察细胞内质网结构的改变;间接免疫荧光法检测泛素化蛋白(ubiquitin)、p62/SQSTM1蛋白和GFP-LC3的共定位;采用免疫共沉淀技术检测p62/SQSTM1与LC3B蛋白之间的相互作用关系;分别观察内质网应激保护剂Salubrinal和内质网应激诱导剂衣霉素(Tunicamycin,TM)对WA诱导的细胞凋亡和自噬的影响;RNAi技术分别沉默相关关键基因CHOP、Atg5、p62/SQSTM1后检测细胞泛素化蛋白、内质网应激相关蛋白以及凋亡和自噬的变化;最后观察抗氧化剂NAC对细胞内质网应激和自噬的影响。结果WA诱导人胰腺癌细胞p62/SQSTM1表达上调,但对其它自噬相关蛋白影响不大;WA能抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路,而抑制mTOR通路后能进一步增加细胞自噬并部分逆转WA所诱导的细胞凋亡效应;WA诱导人胰腺癌细胞泛素化蛋白聚集,且聚集的泛素化蛋白与GFP-LC3共定位;WA诱导人胰腺癌细胞发生内质网应激反应,而抑制内质网应激可减少WA诱导的细胞凋亡和自噬;相反,促进内质网应激可增加WA诱导的细胞凋亡和自噬;并且,抑制细胞自噬可增强WA诱导的泛素化蛋白聚集及内质网应激反应。WA上调p62/SQSTM1的基因转录水平,但不影响其蛋白降解,且p62/SQSTM1与LC3B蛋白为相互作用蛋白;下调p62/SQSTM1后可增强WA诱导的细胞凋亡、自噬和内质网应激反应。最后,WA诱导的内质网应激和自噬反应均可被抗氧化剂NAC所阻断。结论ROS介导的内质网应激反应参与了WA诱导的人胰腺癌细胞凋亡和自噬;WA诱导胰腺癌细胞发生自噬依赖于PI3K/AKT/mTOR信号通路;抑制自噬或增加内质网应激均可显著增强WA对胰腺癌细胞的杀伤作用;p62/SQSTM1介导了自噬溶酶体清除泛素化蛋白和错误未折叠蛋白的过程,并增强了胰腺癌细胞对WA的凋亡抵抗作用。
目录第4-5页
中文摘要第5-9页
Abstract第9-13页
英文缩略词表第14-17页
第一部分 醉茄素A通过氧化应激损伤诱导人胰腺癌细胞凋亡第17-48页
    1.1 前言第17-18页
    1.2 材料和方法第18-29页
    1.3 结果第29-40页
    1.4 讨论第40-43页
    小结第43-44页
    参考文献第44-48页
第二部分 醉茄素A诱导保护性自噬作用的体内外研究第48-68页
    2.1 前言第48-49页
    2.2 材料和方法第49-54页
    2.3 结果第54-62页
    2.4 讨论第62-65页
    小结第65页
    参考文献第65-68页
第三部分 内质网应激反应对醉茄素A诱导人胰腺癌细胞自噬和凋亡的影响及其机制研究第68-87页
    3.1 前言第68-69页
    3.2 材料和方法第69-72页
    3.3 结果第72-81页
    3.4 讨论第81-83页
    小结第83页
    参考文献第83-87页
全文总结第87-88页
本研究的意义和创新点第88-89页
综述第89-105页
    参考文献第97-105页
附录第105-107页
致谢第107页
论文购买
论文编号ABS3617762,这篇论文共107页
会员购买按0.30元/页下载,共需支付32.1
不是会员,注册会员
会员更优惠充值送钱
直接购买按0.5元/页下载,共需要支付53.5
只需这篇论文,无需注册!
直接网上支付,方便快捷!
相关论文

点击收藏 | 在线购卡 | 站内搜索 | 网站地图
版权所有 艾博士论文 Copyright(C) All Rights Reserved
版权申明:本文摘要目录由会员***投稿,艾博士论文编辑,如作者需要删除论文目录请通过QQ告知我们,承诺24小时内删除。
联系方式: QQ:277865656