MS19可能靶向PIK3R1 3UTR对巨噬细胞的活性及炎症应答的影响
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本实验室在研究ODN(寡聚脱氧核苷酸)能否缓解流感病毒感染引起的小鼠急性肺损伤病症时,发现一种ODN(MS19)明显地减轻了流感病毒引起的肺组织病理损伤、阻止小鼠体重下降、减少小鼠死亡率。为了探究其可能作用的机制,我们将其与小鼠核酸数据库进行了BLAST,发现MS19序列能完全碱基互补配对到基因PIK3R1的3’UTR上。然后,我们将目标集中到MS19与PIK3R1之间的关系,首先确定了体外研究的细胞系模型中是否存在靶点基因,其次用实时定量PCR证明了MS19对该基因的表达存在影响。为了探究这种影响的机制是否跟假设一致,我们构建了含靶点的重组质粒,并通过体外转录共孵育实验和重组质粒瞬时共转染实验,验证了猜想的机制。最后,进一步验证了MS19对巨噬细胞功能的影响。
提要 | 第4-5页 |
中文摘要 | 第5-8页 |
Abstract | 第8-10页 |
中英文缩写词表 | 第11-15页 |
第1章 绪论 | 第15-29页 |
1.1 巨噬细胞与炎症 | 第15-16页 |
1.1.1 巨噬细胞 | 第15页 |
1.1.2 巨噬细胞在炎症中的作用 | 第15-16页 |
1.2 巨噬细胞中的PI3K | 第16-22页 |
1.2.1 PI3K家族及其基因型 | 第17-18页 |
1.2.2 PIK3R1基因编码的蛋白 | 第18-20页 |
1.2.3 PIK3R1编码蛋白的研究 | 第20-22页 |
1.3 PIK3R1与MS19 | 第22-23页 |
1.4 抑制性ODN和反义ODN简介 | 第23-27页 |
1.4.1 抑制性ODN | 第24页 |
1.4.2 反义ODN(ASO) | 第24-27页 |
1.5 技术路线 | 第27-29页 |
第2章 材料与方法 | 第29-43页 |
2.1 实验材料 | 第29-31页 |
2.1.1 试剂及材料 | 第29-30页 |
2.1.2 仪器及设备 | 第30-31页 |
2.1.3 ODN | 第31页 |
2.1.4 细胞和载体 | 第31页 |
2.2 实验方法 | 第31-43页 |
2.2.1 细胞的复苏和冻存 | 第31-32页 |
2.2.2 Western blot | 第32-33页 |
2.2.3 流式细胞术 | 第33页 |
2.2.4 qRT-PCR | 第33-35页 |
2.2.5 小鼠全血基因组的提取分离 | 第35-36页 |
2.2.6 T-PIK3R13'UTR的构建 | 第36-37页 |
2.2.7 重组质粒的构建 | 第37页 |
2.2.8 小量质粒的提取 | 第37-38页 |
2.2.9 转化 | 第38-39页 |
2.2.10 转染 | 第39页 |
2.2.11 体外转录 | 第39-40页 |
2.2.12 转录产物与MS19共孵育 | 第40页 |
2.2.13 转染HEK293细胞 | 第40-41页 |
2.2.14 平板黏附实验 | 第41页 |
2.2.15 孔板划痕实验 | 第41页 |
2.2.16 统计学分析 | 第41-43页 |
第3章 实验结果 | 第43-63页 |
3.1 MS19对小鼠巨噬细胞中PIK3R1 mRNA影响初探 | 第43-44页 |
3.1.1 巨噬细胞中PIK3R1 mRNA的检测 | 第43-44页 |
3.1.2 MS19对Raw264.7 细胞中PIK3R1 mRNA的影响 | 第44页 |
3.2 MS19对PIK3R13'UTR靶向机制研究 | 第44-57页 |
3.2.1 小鼠目的基因PIK3R13'UTR的钓取及鉴定 | 第44-48页 |
3.2.2 MS19靶向PIK3R13'UTR作用机制的体外研究 | 第48-51页 |
3.2.3 MS19靶向PIK3R13'UTR的细胞内研究 | 第51-57页 |
3.3 MS19对小鼠巨噬细胞功能的影响 | 第57-63页 |
3.3.1 MS19对巨噬细胞表达的p85α 的影响 | 第57-58页 |
3.3.2 MS19对巨噬细胞中细胞因子的影响 | 第58-59页 |
3.3.3 MS19对巨噬细胞黏附迁移功能的影响 | 第59-63页 |
第4章 讨论 | 第63-65页 |
第5章 结论 | 第65-66页 |
参考文献 | 第66-75页 |
作者简介 | 第75-76页 |
致谢 | 第76-77页 |
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