MS19可能靶向PIK3R1 3UTR对巨噬细胞的活性及炎症应答的影响

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本实验室在研究ODN(寡聚脱氧核苷酸)能否缓解流感病毒感染引起的小鼠急性肺损伤病症时,发现一种ODN(MS19)明显地减轻了流感病毒引起的肺组织病理损伤、阻止小鼠体重下降、减少小鼠死亡率。为了探究其可能作用的机制,我们将其与小鼠核酸数据库进行了BLAST,发现MS19序列能完全碱基互补配对到基因PIK3R1的3’UTR上。然后,我们将目标集中到MS19与PIK3R1之间的关系,首先确定了体外研究的细胞系模型中是否存在靶点基因,其次用实时定量PCR证明了MS19对该基因的表达存在影响。为了探究这种影响的机制是否跟假设一致,我们构建了含靶点的重组质粒,并通过体外转录共孵育实验和重组质粒瞬时共转染实验,验证了猜想的机制。最后,进一步验证了MS19对巨噬细胞功能的影响。
提要第4-5页
中文摘要第5-8页
Abstract第8-10页
中英文缩写词表第11-15页
第1章 绪论第15-29页
    1.1 巨噬细胞与炎症第15-16页
        1.1.1 巨噬细胞第15页
        1.1.2 巨噬细胞在炎症中的作用第15-16页
    1.2 巨噬细胞中的PI3K第16-22页
        1.2.1 PI3K家族及其基因型第17-18页
        1.2.2 PIK3R1基因编码的蛋白第18-20页
        1.2.3 PIK3R1编码蛋白的研究第20-22页
    1.3 PIK3R1与MS19第22-23页
    1.4 抑制性ODN和反义ODN简介第23-27页
        1.4.1 抑制性ODN第24页
        1.4.2 反义ODN(ASO)第24-27页
    1.5 技术路线第27-29页
第2章 材料与方法第29-43页
    2.1 实验材料第29-31页
        2.1.1 试剂及材料第29-30页
        2.1.2 仪器及设备第30-31页
        2.1.3 ODN第31页
        2.1.4 细胞和载体第31页
    2.2 实验方法第31-43页
        2.2.1 细胞的复苏和冻存第31-32页
        2.2.2 Western blot第32-33页
        2.2.3 流式细胞术第33页
        2.2.4 qRT-PCR第33-35页
        2.2.5 小鼠全血基因组的提取分离第35-36页
        2.2.6 T-PIK3R13'UTR的构建第36-37页
        2.2.7 重组质粒的构建第37页
        2.2.8 小量质粒的提取第37-38页
        2.2.9 转化第38-39页
        2.2.10 转染第39页
        2.2.11 体外转录第39-40页
        2.2.12 转录产物与MS19共孵育第40页
        2.2.13 转染HEK293细胞第40-41页
        2.2.14 平板黏附实验第41页
        2.2.15 孔板划痕实验第41页
        2.2.16 统计学分析第41-43页
第3章 实验结果第43-63页
    3.1 MS19对小鼠巨噬细胞中PIK3R1 mRNA影响初探第43-44页
        3.1.1 巨噬细胞中PIK3R1 mRNA的检测第43-44页
        3.1.2 MS19对Raw264.7 细胞中PIK3R1 mRNA的影响第44页
    3.2 MS19对PIK3R13'UTR靶向机制研究第44-57页
        3.2.1 小鼠目的基因PIK3R13'UTR的钓取及鉴定第44-48页
        3.2.2 MS19靶向PIK3R13'UTR作用机制的体外研究第48-51页
        3.2.3 MS19靶向PIK3R13'UTR的细胞内研究第51-57页
    3.3 MS19对小鼠巨噬细胞功能的影响第57-63页
        3.3.1 MS19对巨噬细胞表达的p85α 的影响第57-58页
        3.3.2 MS19对巨噬细胞中细胞因子的影响第58-59页
        3.3.3 MS19对巨噬细胞黏附迁移功能的影响第59-63页
第4章 讨论第63-65页
第5章 结论第65-66页
参考文献第66-75页
作者简介第75-76页
致谢第76-77页
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