目的:构建过表达GSK3β慢病毒载体颗粒,观察小鼠海马齿状回区注射慢病毒后GSK-3β表达的改变,研究慢病毒介导的海马GSK3β过表达对小鼠糖水实验、悬尾实验、强迫游泳等行为的影响,通过慢性应激造模小鼠,初步探讨GSK3β与抑郁障碍的关系。方法:1、构建GSK3β基因过表达的含绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的慢病毒载体。2、将实验动物分为3组:正常组、空载体组和GSK3β过表达组,分别将1ul空载体和含GSK3β基因的慢病毒载体定位注射空载体组和GSK3β过表达组小鼠海马齿状回区,7天后灌注取脑组织做冰冻切片,荧光显微镜下观察GFP与GSK3β表达情况,以及取新鲜组织提取总蛋白及总RNA,通过western blot和RT-PCR的方法检测GSK3β的表达情况;3、48只C57BL/6J小鼠随机分为6组,每组8只,分别为①Lvx-GSK3β+CMS组②Lvx-GSK3β组③Lvx-GFP+CMS组④Lvx-GFP组⑤正常对照+CMS⑥正常对照组。①-④组手术后7天,进行21天的CMS,并观察各组小鼠糖水实验、悬尾实验、强迫游泳实验的变化。结果:1.成功构建出GSK3β的T克隆载体;2.成功构建过表达GSK3β的慢病毒;3.慢病毒定位注射后7天,GSK3β过表达组小鼠海马组织内GSK3βmRNA水平和蛋白水平明显高于空白组与空载体组(P=0.001),而空白组与空载体组GSK3βmRNA和蛋白表达水平无明显差异(P>0.05);定位注射后7天,GSK3β过表达组小鼠海马齿状回区GSK3β阳性细胞数量多,染色深;空白组与空载体组GSK3β阳性细胞较少,染色浅;4.糖水实验结果单因素方差分析显示组间存在明显差异(F=11.5)。LVX-GSK3β组和LVX-GFP组T检验,显示LVX-GSK3β组糖水偏爱明显低于LVX-GFP组(P=0.001), LVX-GSK3β组和正常对照组T检验,显示LVX-GSK3β组糖水偏爱明显低于正常对照组(P=0.001),而LVX-GFP组和正常对照组间则未发现差异。LVX-GSK3β+CMS组和LVX-GFP+CMS组T检验,显示LVX-GSK3β+CMS组糖水偏爱明显低于LVX-GFP+CMS组(P=0.023), LVX-GSK3β+CMS组和正常对照+CMS组T检验,显示LVX-GSK3β+CMS组糖水偏爱明显低于正常对照+CMS组(P=0.025)。但LVX-GFP+CMS组和正常对照+CMS组间则未发现差异;LVX-GSK3β+CMS组与LVX-GSK3β组间没有发现差异,但有一偏低的趋势(P=0.088);5.强迫游泳实验结果单因素方差分析显示组间存在明显差异(F=35.35)。LVX-GSK3β组和LVX-GFP组T检验,显示LVX-GSK3β组不动时间明显高于LVX-GFP组(P=0.001), LVX-GSK3β组和正常对照组T检验,显示LVX-GSK3β组不动时间明显高于正常对照组(P=0.001),而LVX-GFP组和正常对照组间则未发现差异。LVX-GSK3β+CMS组和LVX-GFP+CMS组T检验,显示LVX-GSK3β+CMS组不动时间明显高于LVX-GFP+CMS组(P=0.003), LVX-GSK3β+CMS组和正常对照+CMS组T检验,显示LVX-GSK3β+CMS组不动时间明显高于正常对照+CMS组(P=0.035),但LVX-GFP+CMS组和正常对照+CMS组间则未发现差异。LVX-GSK3β+CMS组与LVX-GSK3β组T检验,结果显示LVX-GSK3β+CMS组不动时间明显高于LVX-GSK3β组(P=0.001)。6.悬尾实验结果单因素方差分析显示组间存在明显差异(F=8.17)。LVX-GSK3β组和LVX-GFP组T检验,显示LVX-GSK3β组不动时间明显高于LVX-GFP组(P=0.036), LVX-GSK3β组和正常对照组T检验,显示LVX-GSK3β组不动时间明显高于正常对照组(P=0.026),而LVX-GFP组和正常对照组间则未发现差异。LVX-GSK3β+CMS组和LVX-GFP+CMS组T检验,显示LVX-GSK3β+CMS组不动时间明显高于LVX-GFP+CMS组(P=0.03), LVX-GSK3β+CMS组和正常对照+CMS组T检验,显示LVX-GSK3β+CMS组不动时间明显高于正常对照+CMS组(P=0.046),但LVX-GFP+CMS组和正常对照+CMS组间则未发现差异。LVX-GSK3β+CMS组与LVX-GSK3β组T检验,结果显示LVX-GSK3β+CMS组不动时间明显高于LVX-GSK3β组(P=0.005)。结论:1、成功构建过表达GSK3β慢病毒。2、成功建立过表达GSK3β的动物模型。3、过表达GSK3β的小鼠,在没有应激时,其糖水实验、强迫游泳实验、悬尾实验均与正常组有明显的差异。提示小鼠海马GSK3β的增多会产生抑郁样行为。4、LVX-GSK3β的小鼠,在应激后,其糖水实验、强迫游泳实验、悬尾实验的结果均与LVX-GFP+CMS组和正常对照+CMS组有明显差异,并且在强迫游泳实验和悬尾实验中发现LVX-GSK3β+CMS组不动时间明显高于LVX-GSK3β组,提示过表达GSK3β小鼠可能对应激更加敏感。
