葛根总黄酮体外诱导APL维甲酸敏感细胞株NB4凋亡的实验研究

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[目的和意义]葛根为江苏省中医院原创制剂“血复康”主要成分之一,临床治疗慢性粒细胞性白血病获得了较好疗效,在急性髓系白血病(acute myelocytic Leukemia, AML)高白细胞症的辅助治疗也取得了一定疗效。近五年来,课题组对葛根主要活性成分葛根总黄酮、葛根素、大豆甙元处理不同AML细胞株的相关研究中发现:葛根素及大豆甙元对相关AML细胞株的增殖影响微乎其微,而葛根总黄酮则具有不同程度的增殖抑制作用;进一步选用Kasumi-1(AML-M2型细胞株,AML1/ETO)、HL-60(AML-M2型细胞株)、NB4和U937(AML-M5型细胞株)细胞株为研究对象,研究葛根总黄酮对不同AML细胞可能的作用,结果发现12.5-200μg/ml PRF体外对不同AML细胞株具有选择性增殖抑制作用,以NB4细胞最强;可影响上述细胞的细胞周期进程,阻滞细胞于S期,促进细胞凋亡。同时,体内实验也证明,上述剂量PRF可以延长NB4细胞异种移植瘤裸鼠的生存周期,抑制移植瘤瘤体的增长。在此研究基础上,本课题采用更低浓度PRF(0-50μg/m1),体外干预急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic Leukemia, APL)维甲酸敏感细胞株NB4,以期进一步探讨较低浓度PRF±TO对NB4细胞增殖及凋亡的影响;借助维甲酸耐药细胞株NB4-R1探讨PRF±TO干预NB4细胞与维甲酸受体可能的关系;PRF诱导的NB4细胞凋亡与MAPK及JNK相关信号通路的相关性和意义。[实验方法]1.实验分组:空白对照组、DMSO溶剂对照组、Oμg/ml PRF±1μM ATO、10μg/ml PRF±1μM ATO、30μg/ml PRF±1μM ATO、50μg/ml PRF±1μM ATO2. PRF±TO作用NB4、NB4-R1细胞24、48、72h,MTT法检测增殖抑制率;3. PRF±TO作用NB4、NB4-R1细胞48h,瑞氏染色观察NB4、NB4-R1细胞形态学变化,激光共聚焦显微技术观察NB4、NB4-R1细胞核形态学变化;流式细胞术FITC-AnnexinV/PI双染法检测NB4、NB4-R1细胞早期凋亡率改变;流式细胞术检测NB4、NB4-R1细胞细胞周期改变;4.采用JNK抑制剂SP600125特异性抑制JNK1/2。分别以Oμg/ml PRF±10μM SP600125、10μg/ml PRF±10μM SP600125、30μg/ml PRF±10μM SP600125、50μg/ml PRF±10μMSP600125处理NB4细胞48h,western blotting检测MAPK及JNK通路相关蛋白表达改变。[结果]1.10、30、50μg/ml PRF±1μM ATO可有效抑制急性早幼粒细胞白血病维甲酸敏感细胞株NB4及维甲酸耐药细胞株NB4-R1增殖,呈浓度-时间依赖性(p<0.05);ATO联合处理组比PRF单药组细胞凋亡更显著,组间具有统计学差异(p<0.05)。ATO在以上时间段能有效抑制NB4细胞增殖,并呈时间依赖性,而24、48h支了促进NB4-R1细胞增殖。10、30、50ng/ml PRF单药处理NB4细胞24、48、72h, IC50分别为39.82、27.45、19.27μg/ml,10、30、50μg/ml PRF+1、M ATO联合组IC50为29.30、21.08、7.56μg/ml;10、30、50μg/ml PRF单药处理NB4-R1细胞,IC50分别为71.66、34.29、31.44μg/ml,10、30、50μg/ml PRF+1μM ATO联合组IC50为38.50、24.28、16.62μg/ml。2.瑞氏染色及激光共聚焦显微技术见对照组细胞形态基本正常,PRF作用48h后,细胞呈现明显凋亡特征。3.10、30、50μg/ml PRF单药处理NB4细胞48h后,细胞早期凋亡率分别为6.6%、9.4%、10.7%,联合1μM ATO则分别为10.0%、10.8%、13.1%,联合组较单药组显著(p<0.05),具有统计学差异;NB4-R1细胞10、30、50μg/ml PRF单药组,分别为7.14%,9.01%,11.38%,联合组分别为8.18%、10.04%、14.59%。以上西种细胞,单药组及联合组早期凋亡率均呈浓度依赖性增加p<0.05),联合组较单药组显著(p<0.05)。4.PRF作用NB4、NB4-R1细胞48h后,30、50μg/ml PRF组均出现亚二倍体细胞,随着浓度增加亚二倍体峰逐渐增高,S期细胞增多,提示PRF影响细胞周期进程,使细胞阻滞于S期。5.随着PRF诱导的NB4细胞凋亡增加,JNK1、JNK2/3、p38MAPK、ERK、TNFα表达上调;SP600125特异性抑制JNKl/2后,不同浓度PRF诱导的NB4细胞JNK1、JNK2/3、p38MAPK表达明显受抑;ERK1/2、TNFa在50μg/ml PRF组表达下调,10、30μg/ml PRF组表达却上调。[结论]10~50μg/ml PRF可有效抑制NB4、NB4-R1细胞增殖,与1μMATO具有协同作用,NB4细胞更敏感;作用靶点与维甲酸受体未见明确关系;作用机制可能是通过TNFa激活MAPK信号途径,JNK、ERK1/2、p38MAPK三者相互作用相互影响,由此激活促凋亡相关蛋白,进而诱导NB4细胞凋亡。
摘要第7-9页
Abstract第9-10页
绪论第11-12页
第一部分 理论研究第12-25页
    1. 急性白血病的中医病机及辨证施治第12-13页
        1.1 白血病中医病因病机第12页
        1.2 中医辩证分型第12-13页
    2. 葛根临床应用相关进展第13-15页
    3. 白血病西K认识及诊治进展第15-18页
    4. 白血病多药耐药机制第18-19页
    5. 多药耐药与细胞死亡调节通路第19-21页
    参考文献第21-25页
第二部分 葛根总黄酮诱导APL维甲酸敏感株NB4凋亡的实验研究第25-53页
    1. 实验目的第25页
    2. 实验材料与方法第25-32页
        2.1 主要仪器设备第25-26页
        2.2 主要材料和试剂第26-27页
        2.3 建立细胞模型第27页
        2.4 实验方法第27-32页
            2.4.1 实验分组第27-28页
            2.4.2 MTT法测定细胞增殖抑制率第28页
            2.4.3 瑞氏染色第28页
            2.4.4 激光共聚焦技术观察细胞核形态第28-29页
            2.4.5 流式细胞术检测细胞凋亡第29-30页
            2.4.6 流式细胞术检测细胞周期第30页
            2.4.7 Western blot法检测JNK相关蛋白表达第30-32页
            2.4.8 统计学数据处理第32页
    3. 实验结果第32-43页
        3.1 PRF对NB4细胞增殖及凋亡的作用第32-36页
        3.2 PRF对NB4-R1细胞增殖及凋亡的作用第36-41页
        3.3 PRF±JNK抑制剂干预NB4细胞JNK、MAPK相关蛋白表达第41-43页
    4. 小结第43-44页
    5. 讨论第44-49页
    参考文献第49-53页
附录第53-56页
攻读博士学位期间取得的研究成果第56-57页
附件第57-68页
致谢第68-69页
作者简介第69页
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