2,3-丁二醇(2,3-BD)是一种非常重要的化工原料,可应用在医药、食品、精细化工等领域。由于2,3-丁二醇具有手性结构,导致化学合成困难；生物法制备因产量、原料等问题导致2,3-丁二醇的生产成本较高,所以目前2,3-丁二醇市场价格偏高、应用范围较窄。微生物发酵法生产2,3-丁二醇的研究已有近百年,能够生产2,3-丁二醇的菌株很多,其中产物浓度较高的是肠杆菌属和克雷伯氏菌属。克雷伯氏菌属为条件致病菌,作为一种工业应用菌种具有很大的局限性和不安全性,而肠杆菌属的的阴沟肠杆菌不仅具有克雷伯氏菌属的优点,如底物谱广、底物利用率高等,而且安全性比克雷伯士杆菌高。为进一步提高其生产2,3-丁二醇的能力,本论文以实验室现有的一株产2,3-丁二醇的菌株为原始菌,通过菌种诱变筛选得到一株高产2,3-丁二醇的突变菌株,产物浓度比原始菌提高20%以上,并建立了低温等离子体和硫酸二乙酯复合诱变方法诱变微生物的新方法。首先,建立了低温等离子体和硫酸二乙酯复合诱变微生物的新方法,并筛选出一株产物浓度明显提高的突变菌。菌种诱变筛选过程为：第一步直接使用2%(v/v)的硫酸二乙酯处理1mL生理盐水菌悬液,置于漩涡振荡器上反应5min,然后吸取500uL的菌液置于等离子体中,调节等离子体发生装置的电压为25kV,电流为1.2mA,电极间距为3mm,处理100s。通过使用该诱变方法处理产2,3-丁二醇菌株,通过摇瓶初筛和复筛最后的到一株高产稳定突变菌株。摇瓶培养发酵液中2,3-丁二醇浓度比原始菌提高了44.27%,批式流加发酵2,3-丁二醇浓度比原始菌提高了27.50%。经过16s rDNA鉴定,该突变菌为Enterobacter cloacae,命名为Enterobacter cloacae DLM,菌种保藏号为CGMCC6503。然后,以Enterobacter cloacae DLM为菌种,确定最佳发酵方式为批式流加发酵,并在发酵过程中流加1000g/L的葡萄糖浆,通气量为0.10vvm,控制pH5.88。在该条件下发酵,突变菌的2,3-丁二醇产量达到125.90g/L,比原始菌提高了43%,同时葡萄糖转化率也达到0.42g/g。使用菊糖为底物发酵,最终2,3-丁二醇浓度为111.62g/L,比原始菌提高了27%。通过中试实验发酵最后2,3-丁二醇浓度为107.18g/L,这比原始菌提高了22%。最后通过连续传代培养,发现该突变菌遗传稳定性良好。实验结果表明筛选到的Enterobacter cloacae DLM具有很强的工业应用前景。
