背景及目的:抑郁症是一种以持续性情绪低落、兴趣缺乏和乐趣丧失为主要表现的精神心理疾病。其发病率、复发率、致残率和自杀率高,目前已成为世界范围内造成疾病负担的第四大原因。关于抑郁症的病因学研究认为生物学因素、心理学因素、社会因素都不同程度地影响到抑郁症的发病和病情的发展。病毒作为一种常见的生物学致病因素,在抑郁症发病中的作用及其机制是一个值得关注与研究的问题。BDV是一种具有高度嗜神经性的单股负链RNA病毒,能持续感染多种动物的中枢神经系统,主要侵犯边缘系统尤其是海马,引起宿主行为障碍,例如焦虑、攻击、过度兴奋、异常游戏行为及认知缺陷等行为障碍,这些症状类似于人类精神分裂症、情感障碍及孤独症等疾病。迄今为止全球多个国家和地区的流行病学调查研究已积累了大量BDV感染与人类抑郁症、精神分裂症等精神疾病的相关性证据。p24和p40蛋白是由BDV基因组中ORFⅠ和ORFⅡ编码的两个病毒结构蛋白,在感染细胞与组织中高度表达,通常作为BDV检测的主要标志物,亦被认为是BDV的主要致病蛋白。重性抑郁、双向情感障碍中存在胶质细胞尤其是星形胶质细胞缺失及功能紊乱,而无神经变性性疾病中所常见的星形胶质细胞反应性增多及神经元变性现象,提示抑郁症与神经胶质细胞之间存在非常密切的关系。因此,本课题旨在构建一个更符合BDV自然感染情况的p24/p40双基因星形胶质细胞特异性表达GFAP转基因小鼠模型,后续进行抑郁行为学评定,以期建立一种新的抑郁症模型---BDV感染诱导的抑郁症模型,并进一步探讨相关细胞分子机制,为抑郁症的BDV感染因子假说提供证据。方法:1.从pQE30-p24和pQE30-p40质粒中扩增克隆p24和p40目的基因。2. P24和p40目的基因与pMD18-T载体进行连接。3.用EcoR I和Nhe I分别对pMD18T-p24与pMD18T-p40质粒和pCMVie-GFAP-Venus质粒进行双酶切,用胶回收试剂盒分别回收p24,p40目的基因和pCMVie-GFAP载体片段,进行连接反应,制备pCMVie-GFAP-p24和pCMVie-GFAP-p40重组质粒。4、选用AseI,NotI和ClaI进行三酶切,电泳得到的最大片段即为注射用片断(包括CMVie,GFAP,p24或p40目的基因,BGH PolyA四个元件),切下条带用Whatman DNA回收系统进行纯化。5、用显微注射法注入小鼠受精卵原核,将导入转基因的受精卵移植至假孕小鼠输卵管,发育产子鼠。6、G0代与G1代小鼠p24/p40基因的PCR检测。结果:通过从pQE30-p24和pQE30-p40质粒中扩增克隆得到正确大小的p24和p40目的基因;与pMD18-T载体进行连接,制备得到pMD18-T-p24载体和pMD18-T-p40载体,测序结果正确;双酶切后及连接制备得到pCMVie-GFAP-p24和pCMVie- GFAP-p40重组质粒,测序结果无异常;三酶切产物电泳后可见三个条带,最大片段即为注射用片断,纯化后p24注射用片断的DNA纯度达55 ng/ul,p40注射用片断的DNA纯度达26 ng/ul;最终产首建鼠144只,PCR检测结果31只基因水平为阳性,双基因阳性率为18.8%。G1代小鼠基因水平检测48只双基因阳性,双基因阳性率为20.60%。结论:本课题初步构建成功了一个更符合BDV自然感染情况的p24/p40双基因星形胶质细胞特异性表达GFAP转基因小鼠模型,为后续进行抑郁行为学评定、深入研究抑郁症相关细胞分子机制或蛋白质组学研究等工作提供了有效工具和平台。
