宫颈癌细胞中Oct4及PinX1基因的表达调控机制研究

研究背景：宫颈癌是严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤。高危亚型人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)的感染和原癌蛋白E6, E7的表达是宫颈癌发生和发展最重要的诱发和推动因素。除HPV外，其他重要分子的表达或者功能异常也参与其中。Oct4作为重要的转录因子，负责维持干细胞的自我更新能力和多能分化的特性，其过表达可促进正常细胞转变成干细胞样细胞，以利于实现细胞的恶性转化和肿瘤的生成。现已证实，Oct4在多种肿瘤中表达上调。端粒酶(telomerase)的激活是促进肿瘤增殖的重要因素，端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)是端粒酶复合物的核心组分。PinX1(the Pin2/TRF1-Interacting Protein X1)则可通过抑制hTERT的活性和表达两个层面来间接抑制端粒酶的活性。已有研究表明，PinX1在多种肿瘤中表达下调。虽然Oct4和PinX1都分别与肿瘤的发生和发展有关，但二者在宫颈癌细胞的中表达状况及其表达调控机制尚不清楚。研究目的：1.探索Oct4和PinX1在HPV阳性和阴性宫颈癌细胞中的表达水平，为阐明这两个分子与宫颈癌的关系提供科学依据。2.探索宫颈癌细胞中Oct4表达的表观遗传学调控机制和HPV16E6对PinX1表达的调控作用及其机制，为以Oct4和PinX1为靶点的抗宫颈癌新策略的研究奠定理论基础。研究方法：1.利用软琼脂克隆形成实验检测HeLa（HPV18感染）、CaSki（HPV16感染）和C-33A（无HPV感染）细胞的克隆形成能力；以RT-PCR、Real time PCR、Western blot及激光共聚焦技术检测Oct4、DNA甲基化转移酶1(DNA methyltransferase1, DNMT1)、DNMT3A、DNMT3B及组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase1, HDAC1)的表达；经亚硫酸氢盐修饰DNA后进行PCR的方法检测三种细胞中Oct4基因富含CG的关键调控区域内的甲基化位点，借助反相高效液相色谱法对全基因组DNA甲基化水平进行分析；用HDAC1的抑制剂丙戊酸(valproic acid, VPA)处理细胞后观察Oct4的表达改变；利用免疫共沉淀技术探讨DNMT3A是否与HDAC1共存于同一复合物中，进而探讨VPA对该复合物的影响。2.设计并合成针对HPV16E6的siRNA，同时构建pEGFP-HPV16E6表达载体。将上述siRNA转染入CaSki细胞，而将上述表达载体转染于C-33A细胞，从而获得HPV16E6原癌蛋白沉默和过表达的宫颈癌细胞模型；然后，利用这两种细胞模型，经RT-PCR、Real-time PCR和Western Blot检测PinX1、核因子kappa B(nuclear factor of kappa B, NF-κB) p50和p65的表达水平；用NF-κB抑制蛋白α(inhibitory protein of NF-κB α, IκBα)磷酸化的抑制剂BAY11-7082处理细胞，观察在NF-κB活性受到抑制时，PinX1表达水平有何改变；借助荧光素酶报告基因检测实验分析NF-κB对PinX1基因启动子区转录活性的影响；经EMSA分析NF-κB与PinX1基因5′调控区内特定序列的结合情况；用端粒重复序列扩增实验(telomeric repeatamplification protocol, TRAP)分析宫颈癌细胞端粒酶活性；经[3H]TdR掺入实验检测细胞增殖情况。研究结果：1. HPV阳性的宫颈癌细胞（HeLa和CaSki）中Oct4的mRNA和蛋白水平均显著高于HPV阴性宫颈癌细胞（C-33A），并与细胞的克隆形成能力呈正相关；而DNMT3A和HDAC1在C-33A细胞中的mRNA和蛋白水平显著高于HeLa和CaSki细胞。DNMT3A既不通过对Oct4基因调控区的甲基化修饰来抑制Oct4基因的转录，也不足以影响全基因组DNA甲基化水平。DNMT3A和HDAC1共存于一个复合物中，该复合物的水平与Oct4基因的表达水平呈负相关，抑制HDAC1活性可促进Oct4表达。2. HPV16E6可上调NF-κB p65表达，而下调PinX1表达。抑制IκBα的磷酸化可有效减弱E6对PinX1的抑制作用。报告基因实验显示，NF-κB可抑制PinX1基因启动子区的转录活性。EMSA实验显示，NF-κB可与PinX1基因5′调控区中的-909～-898位点序列结合。HPV16E6的水平与宫颈癌细胞端粒酶活性和细胞增殖能力呈正相关；抑制IκBα的磷酸化可削弱由HPV16E6所导致的宫颈癌细胞端粒酶活性以及细胞增殖能力的升高。结论：1. HPV感染与Oct4的表达水平呈正相关，而与DNMT3A和HDAC1的表达水平呈负相关；Oct4可促进宫颈癌细胞克隆形成能力；DNMT3A对Oct4基因的甲基化及全基因组DNA甲基化水平无明显影响；DNMT3A和HDAC1存在于同一复合物中，该复合物可能抑制了Oct4基因的表达；高危亚型HPV的感染可能通过调节HDAC1的活性而降低该复合物的水平，从而上调Oct4的水平。2. NF-κB可负性调控PinX1基因的表达，HPV16E6的表达可能通过激活NF-κB而抑制PinX1，从而削弱PinX1对端粒酶活性的抑制作用，进而使端粒酶活性及细胞增殖能力升高。3. Oct4和PinX1有可能作为宫颈癌治疗的新靶点。