目的克隆人WWOX (WW domain-containing oxidoreductase)基因,构建及鉴定WWOX基因的真核表达载体,观察其在人胆囊癌细胞株GBC-SD中的表达,并探讨WWOX基因转染人胆囊癌细胞株GBC-SD后对其增殖、凋亡的影响。方法提取胆囊癌细胞株GBC-SD中总RNA,采用反转录RCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)扩增WWOX全基因序列,用限制性内切酶ECOR Ⅰ和Xho Ⅰ做双酶切,将该基因连接至真核表达载体pcDNA3.0中,构建真核表达载体pcDNA3.0-WWOX,通过限制性内切酶ECOR Ⅰ和Xho Ⅰ做双酶切分析,并运用DNA序列分析鉴定重组质粒。将测序正确的重组质粒转染人胆囊癌细胞株GBC-SD,应用RT-PCR、细胞免疫荧光方法、Western Blot检测WWOX基因的表达,并用MTT、流式细胞仪检测GBC-SD细胞的增殖、凋亡情况。结果1.成功地建立了重组质粒pcDNA3.0-WWOX,经测序DNA序列分析结果与Gene Bank中WWOX序列一致。2.成功地转染重组质粒pcDNA3.0-WWOX至胆囊癌细胞株GBC-SD细胞中。3.RT-PCR结果示转染重组质粒组WWOX基因的RNA水平明显高于对照组。4.细胞免疫荧光结果显示转染重组质粒组WWOX基因蛋白的表达水平明显高于对照组。5. Western Blot结果显示转染重组质粒组WWOX基因蛋白的表达水平明显高于对照组。6.MTT法检测转染重组质粒pcDNA3.0-WWOX舌,胆囊癌细胞GBC-SD细胞增殖显著受到抑制。7.流式细胞仪检测转染重组质粒pcDNA3.0-WWOX后,胆囊癌细胞GBC-SD细胞凋亡明显增加。结论1. RT-PCR法准确地获得目的基因WWOX cDNA片段,正确地构建了重组质粒载体pcDNA3.0-WWOX。2.重组质粒pcDNA3.0-WWOX成功转染胆囊癌细胞GBC-SD,转染WWOX基因后GBC-SD细胞生长增殖受到显著的抑制,WWOX基因诱导GBC-SD细胞的凋亡。
