晶状体上皮细胞TGF-β/Smad信号转导通路的研究

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目的:后囊膜混浊(Posterior capsule opacification, PCO)是白内障术后引起视力下降的常见并发症。晶状体上皮细胞TGF-β/Smad信号转导途径得到越来越多的关注。本文采用RNA干扰技术,分别阻断TGF-β2/Smad2、TGF-β2/Smad3和TGF-β2/Smad2&3信号转导通路。研究目的是构建Smad2和Smad3 siRNA的表达质粒,以HLEβ-3细胞为研究对象,探讨TGF-β2/Smad2和TGF-β2/Smad3信号传导途径分别对于HLE B-3细胞增殖、迁移和细胞外基质产生的调节作用,评价其在后囊膜混浊发生中的作用。方法:本研究包括两部分:1.分别设计人晶状体上皮细胞的siRNA,以pSilencer2.1-U6neo为质粒载体,构建Smad2和Smad3的siRNA表达质粒,转化大肠杆菌,酶切、测序进行鉴定。2.体外培养HLE B-3细胞,利用siRNA分别阻断Smad2, Smad3, Smad2和&3信号传导途径。通过MTT和细胞生长曲线实验评价细胞增殖,通过transwell和划痕实验评价细胞迁移,通过real-time PCR评价aSMA、纤维素和Ⅰ型胶原的表达。结果:1.合成的DNA序列退火后克隆到pSilencer2.1-U6neo质粒载体上,进行酶切、测序分析,确定为所需序列。2.阻断Smad2组MTT实验570nm光吸收值和细胞生长曲线细胞计数TGF-β2组明显低于对照组(P<0.05),纤维素和Ⅰ型胶原表达TGF-β2组明显高于对照组(P<0.05), aSMA表达、划痕实验细胞迁移距离和transwell迁移细胞数TGF-β2组与对照组没有显著性差异(P>0.05);阻断Smad3组aSMA表达,划痕实验细胞迁移距离和transwell迁移细胞数明显高于对照组(P<0.05), MTT实验570nm光吸收值,细胞生长曲线细胞计数,纤维素和Ⅰ型胶原表达TGF-β2组与对照组没有显著性差异(P>0.05)。同时阻断Smad2和Smad3组,MTT实验570nm光吸收值和细胞生长曲线细胞计数,aSMA、纤维素和Ⅰ型胶原表达,划痕实验细胞迁移距离和transwell迁移细胞数TGF-β2组与对照组没有显著性差异(P>0.05)。结论:1. Smad2和Smad3 siRNA表达质粒能有效阻断TGF-β2/Smad2、TGF-β2/Smad3和TGF-β2/Smad2&3信号转导通路,及Smad2和Smad3mRNA和蛋白的表达。2. Smad3可以阻断TGF-β2对于细胞增殖和ECM产生的调节,阻断Smad2可以阻断TGF-β2对于细胞迁移和aSMA产生的调节。3. Smad2耗竭可以加强Smad3的活性,Smad3耗竭可以加强Smad2的活性。4.只有阻断Smad2和Smad3信号转导通路,才可以有效阻断TGF-β2在晶状体上皮细胞增殖、迁移和ECM产生的调节作用。从而有效阻断PCO的形成。
中文摘要第4-6页
Abstract第6-7页
缩略语第10-11页
前言第11-16页
    研究现状、成果第11-14页
    研究目的、方法第14-16页
一、Smad2和Smad3 siRNA质粒载体的构建和验证第16-29页
    1.1 对象和方法第16-22页
        1.1.1 实验材料第16-17页
        1.1.2 实验方法第17-22页
    1.2 结果第22-24页
    1.3 讨论第24-28页
    1.4 小结第28-29页
二、TGF-β2/Smad信号转导通路的研究第29-65页
    2.1 对象和方法第29-38页
        2.1.1 细胞系第29页
        2.1.2 主要试剂第29-30页
        2.1.3 主要仪器第30页
        2.1.4 实验方法第30-38页
    2.2 结果第38-56页
        2.2.1 Western blot检测Smad2和Smad3蛋白在转染Smad2siRNA、Smad 第38页
        2.2.2 MTT验证TGF-β通过TGF-β/Smad3信号转导途径抑制HLE B-3细胞增殖第38-40页
        2.2.3 细胞生长曲线验证TGF-β2通过TGF-β2/Smad3信号转导途径抑制HLE B-3细胞增殖第40-45页
        2.2.4 划痕实验验证TGF-β2通过TGF-β2/Smad2信号转导途径促进HLE B-3细胞迁移第45-53页
        2.2.5 Transwell实验验证TGF-β2通过TGF-β2/Smad2信号转导途径促进HLE B-3细胞迁移第53-54页
        2.2.6 TGF-β2影响细胞外基质的产生通过TGF-β2/Smad2&3信号转导通路第54-56页
    2.3 讨论第56-64页
    2.4 小结第64-65页
结论第65-66页
论文创新点第66-67页
参考文献第67-76页
发表论文和参加科研情况说明第76-77页
综述 TGF-β/Smad信号转导通路及其研究进展第77-96页
    参考文献第88-96页
致谢第96页
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