骆驼科动物除了拥有传统重链和轻链组成的异源双链抗体外,还拥有一种天然缺失轻链,只由同源重链二聚体形成的重链抗体(Heavy-chain antibodies,HCAbs),克隆其可变区得到的单域抗体是最小的功能性抗原结合片段,称为重链抗体重链可变区(Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibodies,VHHs),由于其大小只有传统抗体的1/10,亦称纳米抗体(Nanobody)。相对于传统抗体,纳米抗体具有相对分子质量小、可溶性高、稳定性强、易表达生产等特点。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)是由692个氨基酸组成的分泌型丝氨酸蛋白酶,它能介导低密度脂蛋白受体降解,导致血浆低密度脂蛋白胆固醇水平升高,增加患心血管疾病的风险。PCSK9单克隆抗体药物是最新上市的高特异性降脂药,但是其价格昂贵,目前只用于遗传性高胆固醇血症的治疗。本研究旨在研发PCSK9特异性纳米抗体,采用人胚肾细胞(Human embryo kidney 293F，HEK293F)表达纯化PCSK9蛋白,免疫双峰骆驼,通过高通量测序技术和蛋白质组学技术,筛选出特异性PCSK9纳米抗体。主要内容如下:1、成功构建了包含PCSK9基因的pYD7重组蛋白表达质粒,实现了PCSK9蛋白在HEK293F细胞的分泌表达。所表达的蛋白分子量约为60kDa,与人天然的PCSK9蛋白分子量相同,且纯度可以达到87.38%,平均表达量达到4 mg/L以上。2、通过酶联免疫吸附反应(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定特异性抗PCSK9的重链抗体的免疫应答曲线,发现经过三次免疫之后,抗体效价达到1:256000。同时,采集PCSK9蛋白免疫后的双峰骆驼血清,串联使用Protein G和Protein A纯化柱提取血清中的重链抗体,再经偶联PCSK9的磁珠进一步纯化,获得特异性抗PCSK9重链抗体,为蛋白组学技术分析重链抗体氨基酸序列提供样品。3、通过分离骆驼外周血单核细胞,提取mRNA,利用多重PCR和Illumina Mi-seq高通量测序技术对三头双峰骆驼的重链抗体可变区进行深度测序,分析了重链抗体组库V、J基因组成、重排时末端基因删除数和V-J基因配对率,以及CDR3的长度、香农多样性指数(Shannon index)、氨基酸组成分布等基本特征。鉴定出平均每头胳驼130000条有效数据和67561条独特CDR3序列,重链抗体含量较高的V基因为IGHV1S45、IGHV1S50和IGHV1S52,J基因为IGHJ4和IGHJ6,所对应的V-J基因配对含量大于40%。这些骆驼重链抗体组库的基本特征分析为进一步制定筛选高特异性纳米抗体的算法奠定了基础。本研究成功建立了在HEK293F细胞快速制备毫克级PCSK9蛋白的方法,免疫骆驼后,测定了多克隆抗体血清中特异性抗PCSK9重链抗体的效价,制备纯化了特异性抗PCSK9重链抗体,同时,分析了双峰骆驼重链抗体组库的基本特征,为后续采用高通量测序和蛋白质组学技术筛选鉴定高特异性和高亲和力PCSK9纳米抗体奠定基础。
