1、组织激肽释放酶8（KLK8）保护心肌细胞缺血—再灌注损伤及诱导心肌细胞肥大的作用 2、雌激素通过调节KLK8抑制心肌细胞肥大的作用

心血管疾病已经成为仅次于恶性肿瘤的第二号杀手，是造成死亡的主要原因之一。而心肌肥大以及心肌缺血后引起的心肌细胞死亡和炎症是导致心室重构、心力衰竭的前驱病变，也是心血管疾病发病率和死亡率增高的独立危险因子[1]。组织激肽释放酶-激肽系统（kallikrein-kinin system，KKS）是存在于心血管系统中重要的血管活性物质，以往的研究主要是KLK1（即经典组织激肽释放酶），表明KLK1对心脏具有抗缺血-再灌注损伤、抗心肌细胞凋亡[2]和抗心肌细胞肥大[3-4]等保护作用，而此保护作用主要是通过生成缓激肽，然后再作用于缓激肽B2受体完成。KLK-8是组织肽释放酶家族成员之一，并且在心脏组织中也有表达[5]，然而KLK8是否具有与KLK1类似的心血管活性作用至今仍未阐明。我们在前期研究中发现，大鼠心脏缺血—再灌注模型中心脏组织KLK1表达明显下降，而KLK8表达则显著增高；四月龄的自发性高血压大鼠（SHR）心肌明显肥大，我们发现其心脏组织中KLK1表达水平无明显变化，而KLK8水平也是显著升高的。这些结果提示，虽然KLK8与KLK1基因结构近似，也具有某些共同的生物学活性[6]，但是在心脏疾病中的作用可能是不一样的。因此，本课题的第一部分主要研究KLK8在心肌缺血性损伤和心肌肥大过程中的表达变化、作用及其机制，结果表明KLK8具有抗心肌缺血—再灌注损伤及诱导心肌肥大的作用。此外，大量在体和离体研究表明雌激素具有显著的抗心肌肥大作用，并且已有文献报道雌激素可调节某些组织激肽释放酶家族成员如KLK4、KLK12等的表达[7]，那么雌激素是否通过调节心肌KLK8的表达继而抑制心肌细胞肥大呢？结合第一部份研究，我们在第二部分主要研究雌激素对KLK8表达的影响，并探讨雌激素、KLK8和心肌肥大之间的关系，进一步阐明雌激素抗心肌肥大的机制。主要研究内容与结果如下：第一部分KLK8保护心肌细胞缺血—再灌注损伤及诱导心肌细胞肥大的作用（一）KLK1和KLK8在心肌缺血—再灌注后的表达变化制作大鼠缺血—再灌注模型，通过real time PCR和western blot方法检测缺血—再灌注后大鼠心脏组织KLK1及KLK8mRNA和蛋白表达。结果表明，与假手术大鼠相比，缺血再灌注大鼠心肌组织中KLK1表达明显下降，而KLK8表达显著增多。（二）KLK1和KLK8在SHR大鼠肥厚心肌中的表达变化1.4月龄的SHR大鼠心肌组织中心肌细胞肥大标志物ANP、BNP和Myh7的mRNA表达较之对照WKR大鼠显著升高，提示心脏发生明显肥大。2.通过real time PCR和western blot方法检测SHR大鼠及其对照WKR大鼠心脏组织KLK1及KLK8mRNA和蛋白表达。结果表明，与WKR大鼠相比，SHR大鼠心肌组织中KLK1表达无明显变化，而KLK8表达显著增多。（三）大鼠Ad-KLK8腺病毒载体的构建和鉴定采用AdEasyTMXL系统细菌内同源重组的方式来构建腺病毒。1.构建插入大鼠KLK8全长cDNA片段的穿梭质粒pShuttle-CMV-KLK8。2.经过Pme I酶切线性化后的pShuttle-CMV-KLK8质粒与骨架载体pAdEasy-1上的腺病毒基因组在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组，同时经过卡那霉素筛选得到重组腺病毒pAd-KLK8质粒。3.通过Pac I内切酶充分线性化重组腺病毒pAd-KLK8质粒，转染腺病毒包装细胞系AD293细胞，得到腺病毒感染颗粒。4.大量扩增腺病毒后，CsCl梯度离心法纯化腺病毒，通过TCID50法测定病毒滴度为3.161012IU/ml5.纯化后的腺病毒感染AD293，通过real time PCR和western blot方法检测AD293细胞中KLK8的表达，结果表明此腺病毒载体可使细胞表达正确的KLK8mRNA和蛋白并且表达水平显著增加。（四）KLK8保护心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用体外培养乳鼠心肌细胞，采用低氧-复氧（H/R）处理来模拟心肌缺血—再灌注损伤，具体方法如下：采用无血清DMEM培养液，置于3%O2-92%N2-5%CO2培养箱培养24h（低氧）后再于5%C02-95%air孵育2h（复氧）。进而通过转染特异性针对KLK8的小干扰RNA（siRNA）片段和感染KLK8腺病毒表达载体的方法分别使心肌细胞低表达和过表达KLK8，从而探讨KLK8对于心肌低氧-复氧损伤的作用及机制。心肌细胞损伤及凋亡指标采用MTT细胞活力测定、培养液上清LDH定量、Hoechst33258染色检测细胞凋亡和Annexin-V/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞存活率。具体结果如下：1. KLK8siRNA转染心肌细胞后，KLK8mRNA表达明显下降。同时，在常氧条件，KLK8siRNA转染后心肌细胞活力明显下降，而上清LDH含量、心肌细胞凋亡率明显及心肌细胞Cleaved caspase3水平明显上升；KLK8siRNA转染并施加H/R后，心肌细胞活力相对于control siRNA+H/R进一步降低，并且上清LDH含量、心肌细胞凋亡率及及心肌细胞Cleaved caspase3水平也相对于controlsiRNA+H/R进一步升高，提示：KLK8siRNA转染细胞后心肌损伤程度增加。2. Ad-KLK8转染心肌细胞后，KLK8蛋白表达明显增加。同时，在常氧条件，Ad-KLK8转染后心肌细胞活力明显升高，而上清LDH含量、心肌细胞凋亡率及心肌细胞Cleaved caspase3水平明显下降；Ad-KLK8转染并施加H/R后，心肌细胞活力相对于Ad-vector+H/R显著提高，并且上清LDH含量、心肌细胞凋亡率及Cleaved caspase3水平相对于Ad-vector+H/R也明显降低，提示：Ad-KLK8转染细胞后心肌损伤程度减轻。3.在Ad-KLK8转染心肌细胞后分别施加缓激肽B1受体阻断剂R-715和缓激肽B2受体阻断剂HOE140，发现无论在常氧还是在H/R条件下，HOE140均能阻断KLK8对心肌细胞的保护作用，而R-715无明显作用，提示：缓激肽B2受体介导了KLK8对心肌的保护作用。上述结果提示：KLK8具有抗心肌细胞损伤和凋亡的保护作用，并且此作用是通过缓激肽B2受体介导。（五）KLK8诱导心肌肥大的作用体外培养心肌细胞，对心肌细胞施以PE构建心肌细胞肥大模型，通过腺病毒感染和siRNA使心肌细胞过表达和低表达KLK8，同时使用缓激肽B1及B2受体阻断剂R-715TFA salt和HOE140，而后使用KLK8活性抑制剂Antipain和ZnSO4，探讨KLK8在心肌肥大过程中的作用及其作用的途径和机制。通过检测ANP mRNA、BNP mRNA、Myh7mRNA等心肌肥大标志物、心肌细胞总蛋白含量和心肌细胞表面积测定来反映心肌细胞肥大程度。1. KLK8siRNA转染心肌细胞后，ANP mRNA、BNP mRNA、Myh7mRNA表达水平、心肌细胞总蛋白含量和心肌细胞表面积无明显变化；而KLK8siRNA转染并施加PE诱导细胞肥大后，ANP mRNA、BNP mRNA、Myh7mRNA表达、心肌细胞总蛋白含量和心肌细胞表面积相对于control siRNA+PE显著减少。提示：KLK8siRNA可减轻PE所诱导的心肌细胞肥大。2. Ad-KLK8转染心肌细胞后，ANP mRNA、BNP mRNA、Myh7mRNA表达水平、心肌细胞总蛋白含量和心肌细胞表面积明显增加，而Ad-KLK8转染并施加PE诱导细胞肥大后，ANP mRNA、BNP mRNA、Myh7mRNA表达、心肌细胞总蛋白含量和心肌细胞表面积相对于Ad-vector+PE显著增加。提示：Ad-KLK8可加剧PE所诱导的心肌细胞肥大。3.在Ad-KLK8转染心肌细胞后分别施加缓激肽B1受体阻断剂R-715和缓激肽B2受体阻断剂HOE140，发现无论是在单独使用Ad-KLK8还是在Ad-KLK8+PE诱导条件下，R-715和HOE140均不能阻断KLK8诱导心肌细胞肥大作用，提示：KLK8诱导心肌肥大的作用不是通过缓激肽受体完成，而是通过其他途径。4.在Ad-KLK8转染心肌细胞后分别施加KLK8活性抑制剂Antipain和ZnSO4，发现无论是在单独使用Ad-KLK8还是在Ad-KLK8+PE诱导条件下，Antipain和ZnSO4均可阻断KLK8诱导心肌细胞肥大作用，提示：KLK8诱导心肌肥大的作用是通过其自身的酶活性完成。上述结果提示：KLK8可诱导心肌细胞肥大，并且此作用不是通过缓激肽B1和B2受体，而是通过其自身的酶活性完成。第二部分雌激素调节KLK8抑制心肌肥大的作用1.整体心脏和体外培养心肌细胞，通过real time PCR法检测雌激素对心脏或心肌细胞KLK8mRNA的影响。我们发现，去卵巢大鼠心脏KLK8mRNA表达显著增高，而给予雌激素替代处理后，大鼠心脏KLK8mRNA表达可以恢复到正常水平。同时，在培养心肌细胞上也发现了雌激素能够抑制KLK8mRNA，提示雌激素可抑制心肌KLK8表达。2.体外培养心肌细胞，通过PE诱导心肌细胞肥大，我们观察到肥大心肌细胞中KLK8mRNA表达升高；而雌激素可抑制PE诱导的心肌细胞肥大，同时抑制KLK8mRNA的表达。结合第一部分的结果，提示雌激素可能通过抑制KLK8的表达来发挥抗心肌细胞肥大的作用。3.雌激素抑制PE诱导的心肌细胞肥大的作用可以被ERβ特异性阻断剂THC完全阻断，提示雌激素是抑制心肌细胞肥大的作用是通过ERβ实现的。四、结论：KLK8具有抗心肌缺血—再灌注损伤及诱导心肌细胞肥大的作用。同时，雌激素能抑制KLK8的表达，并且雌激素的抗心肌细胞肥大作用有可能部分通过抑制KLK8表达来完成。