茉莉酸甲酯处理雷公藤悬浮细胞的基因差异表达分析

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雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)作为一种具有很好应用和开发前景的农用资源植物,其市场需求日益加大。为利用现代生物技术调控雷公藤次生代谢产物生物碱的生物合成提供依据,本文以茉莉酸甲酯(MeJA)为诱导子,采用继代3周的雷公藤悬浮细胞为材料,通过cDNA-AFLP技术分析了MeJA诱导处理前后雷公藤悬浮细胞中差异基因的表达情况,主要得到了以下结论:1 MeJA在50μM至400μM浓度范围内对雷公藤总生物碱含量的积累呈抑制作用。未用MeJA处理的悬浮细胞中总生物碱的含量达到了624.13μg·g-1 ,而不同浓度MeJA处理对总生物碱的积累影响不同,其中200μM浓度处理下总碱的含量略高于其他处理浓度,为478.76μg·g-1,仍然低于未用MeJA处理的。2通过优化RNA的提取、酶切、连接、预扩增和选择性扩增等步骤,建立了适宜MeJA诱导下雷公藤悬浮细胞差异基因表达的cDNA-AFLP体系。3利用64对AFLP扩增引物对处理和对照的cDNA进行AFLP分析和Blastn生物信息比对,共筛选到19条明显差异表达的cDNA片段。其中有7条找到同源序列,这些基因可能参与了细胞中的信号转导,转录调控和能量代谢等。12条未在数据库中找到同源信息,推测为未知基因,有待进一步验证。4在比对出的7条TDFs中,A2T4C4片段与MYB蛋白基因同源(Blastn比对结果为100%)。MYB蛋白做为一类转录因子组成的一部分,对揭示次生代谢物转录调节机制有重要意义,推测MYB基因可能参与了茉莉酸甲酯调控的雷公藤悬浮细胞次生代谢物质的合成。对此,有待于获得A2T4C4片段其全长序列,并转入雷公藤悬浮细胞培养体系,在雷公藤悬浮细胞中做转化验证。
摘要第5-6页
ABSTRACT第6-7页
第一章 文献综述第10-19页
    1.1 雷公藤研究进展第10-12页
        1.1.1 雷公藤活性成份研究第10-11页
        1.1.2 雷公藤杀虫活性研究概况第11-12页
        1.1.3 雷公藤组织培养研究进展第12页
    1.2 MeJA 在次级代谢产物信号转导中的作用第12-13页
    1.3 基因差异表达研究技术第13-17页
        1.3.1 mRNA 差异显示(DDRT-PCR)第13-14页
        1.3.2 cDNA 代表性差异分析(cDNA-RDA)第14页
        1.3.3 抑制性消减杂交(SSH)第14-15页
        1.3.4 cDNA-AFLP 技术第15-17页
    1.4 本研究的立题依据及试验设计思路第17-19页
第二章 材料和方法第19-28页
    2.1 供试材料第19页
        2.1.1 试验材料第19页
        2.1.2 菌种和质粒第19页
        2.1.3 主要试剂第19页
        2.1.4 主要仪器设备第19页
    2.2 研究方法第19-28页
        2.2.1 雷公藤悬浮细胞的培养第19页
        2.2.2 茉莉酸甲酯诱导处理第19-20页
        2.2.3 雷公藤悬浮细胞鲜重和干重的测定第20页
        2.2.4 雷公藤悬浮细胞中总生物碱的提取和测定第20页
        2.2.5 雷公藤悬浮细胞总RNA 的提取第20页
        2.2.6 cDNA-AFLP 分析第20-24页
        2.2.7 差异条带的分离和测序第24-26页
        2.2.8 RT-PCR 验证获得的差异基因在雷公藤悬浮细胞中的表达第26-28页
第三章 结果与分析第28-33页
    3.1 不同浓度茉莉酸甲酯对雷公藤悬浮细胞生长量和总生物碱积累的影响第28-29页
    3.2 RNA 的提取第29页
    3.3 选择性扩增第29-30页
    3.4 差异片段的二次扩增和克隆第30页
    3.5 7 条差异片段的基因序列分析第30-31页
    3.6 RT-PCR 检测第31-33页
第四章 问题与讨论第33-38页
    4.1 MeJA 抑制雷公藤悬浮细胞总生物碱的合成第33-34页
    4.2 cDNA-AFLP 生物信息学比对结果第34-35页
        4.2.1 MYB 转录因子可能参与了雷公藤悬浮细胞总生物碱的合成第34-35页
        4.2.2 与雷公藤次生代谢产物信号转导相关的基因片段第35页
    4.3 cDNA-AFLP 方法有关问题探讨第35-36页
        4.3.1 高质量RNA 的提取第35-36页
        4.3.2 降低cDNA-AFLP 技术中的假阳性第36页
        4.3.3 RT-PCR 结果有待进一步完善第36页
    4.4 下一步研究计划第36-38页
第五章 结论第38-39页
参考文献第39-44页
附表:测序并比对的碱基序列第44-48页
致谢第48-49页
作者简介第49页
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