细菌生物被膜是由细菌及其分泌的胞外基质所形成的多细胞结构,它是抗生素渗透和作用的物理屏障。一直以来,细菌胞外多糖被认为是生物被膜形成的重要因子,不但起始细菌的粘附,而且在生物被膜复杂结构的形成中也发挥重要的作用。然而,近期研究却发现少数几种细菌的胞外多糖(例如E. coli II型荚膜多糖)不但不参与生物被膜的形成,而且能抑制其自身甚至其它细菌的生物被膜形成。本实验室在前期工作中发现Vibrio sp.QY101发酵液粗提物具有广谱的生物被膜抑制活性,进一步证明此活性与多糖类物质有关。本文旨在对QY101所分泌的抗细菌生物被膜活性多糖进行分离纯化,分析其性质、组成,并深入研究抗细菌生物被膜活性及作用机制。实验首先采用离子交换色谱和凝胶排阻色谱相结合对QY101发酵液中的多糖进行分离纯化,得到具有抗细菌生物被膜活性的多糖A101。采用现代仪器分析手段,包括IR、HPSEC、HPLC等,对A101的结构特征、化学组成及分子量进行分析。结果表明A101分子量高达546kDa,其单糖组成较复杂,但是以糖醛酸为主、其次为鼠李糖和氨基葡萄糖,其他单糖含量很低。将A101与已知弧菌胞外多糖进行比较,结果显示A101与具有生物被膜抑制活性的Vibrio vulnificus MO6-24 I型荚膜多糖相似,都是以糖醛酸为主、带负电荷的胞外多糖。进一步基因克隆和生物信息学分析表明菌株Vibrio sp.QY101中的确存在I型荚膜多糖转运蛋白(Wza),根据以上结果我们推测A101可能是QY101的I型荚膜多糖。细菌生物被膜形成能力评价体系包括静态模型和动态模型,为了能对生物被膜进行实时观察,首先构建了金黄色葡萄球菌的绿色荧光蛋白表达株RN6390-GFP,荧光倒置显微镜及激光共聚焦结果显示,Flow cell中的RN6390生物被膜在24 h达到成熟,而且在以后较长时间内处于动态平衡的稳定状态。在静态模型条件下,A101对铜绿假单胞菌FRD1和金黄色葡萄球菌RN6390生物被膜的形成都具有明显的抑制作用,而且这种抑制作用具有浓度依赖性。当A101的浓度达到100μg/mL时,其对铜绿假单胞菌FRD1生物被膜的抑制率达75%,对金黄色葡萄球菌RN6390的抑制率超过90%。进一步研究显示,A101的抗生物被膜活性具有普遍性,在测试菌株中,80%(12/15)的革兰氏阴性菌和70%(7/10)的革兰氏阳性菌的生物被膜形成均可以被有效抑制,其中有效率超过50%的达48%(12/25)。在动态的Flow cell模型中,A101的生物被膜抑制活性更为明显,100μg/mL的A101对铜绿假单胞菌FRD1生物被膜抑制率达95%以上,而对金黄色葡萄球菌RN6390的抑制率甚至超过99%。实验中还利用Flow cell模型检测了A101对菌体成熟生物被膜的清除作用,结果显示,100μg/mL A101作用12h对铜绿假单胞菌FRD1成熟生物被膜的清除率即可达85%以上,然而A101对成熟的金黄色葡萄球菌RN6390生物被膜没有清除作用。我们对A101作用机制进行了初步探讨:A101酸完全降解产物失去抗生物被膜活性表明多糖的完整性及复杂结构是其发挥功能所必须的;浮游菌的生长曲线测定结果显示,A101对浮游细菌的生长有略微的促进作用,这表明A101的抗生物被膜活性与抑菌活性无关;细胞粘附性实验显示,A101能够显著降低金黄色葡萄球菌RN6390对材料表面的粘附,而对铜绿假单胞菌FRD1的粘附没有影响;细胞聚集体实验表明,A101对铜绿假单胞菌FRD1和金黄色葡萄球菌RN6390细胞聚集体的形成都具有显著的抑制作用,A101能够破坏铜绿假单胞菌FRD1已形成的细胞聚集体,而对金黄色葡萄球菌RN6390的菌体聚集体没有影响。上述结果表明,A101通过其复杂的结构影响菌体细胞和介质表面及菌体细胞间的相互作用而发挥其抗生物被膜活性。综上所述,本文从Vibrio sp.QY101发酵液中分离纯化到一种既具有广谱生物被膜抑制活性,又具有成熟生物被膜清除作用的胞外多糖,并对该多糖的抗生物被膜作用机制作了初步的探讨。本文的研究为开发细菌生物被膜相关感染的预防和治疗药物开辟了新的途径,并为细菌胞外多糖的生物活性提供新的补充。
