燕麦遗传转化体系的建立和披碱草再生体系的建立

本文拟研究燕麦(Oat)的组织培养及其植株再生，建立它们的遗传转化体系，通过根癌农杆菌EHA105介导，把来自类产碱假单胞菌的杀虫毒蛋白基因PPIP转入燕麦，培育出具有抗虫能力的牧草新材料；研究短芒披碱草(Elymus breviaristatus)的组织培养及其植株再生，为将PPIP基因转入短芒披碱草作好准备。建立了短芒披碱草的胚性愈伤组织诱导和再生体系。研究结果表明：外植体来源，和植物生长调节剂组合等是影响愈伤组织诱导和植株再生的主要因素。分析比较了短芒披碱草成熟胚，下胚轴和幼叶三种来源的外植体，其中成熟胚的出愈率最高，平均达到了47.82％。短芒披碱草愈伤组织诱导的最适培养基均为MS培养基，最佳的激素组合为5mg／L 2，4-D+0.05mg／L KT+2mg／LABA。同时发现添加1mg／L左右的酪蛋白水解液能够明显提高愈伤组织的生长质量，可以改善愈伤组织的质量，提高愈伤组织的分化能力。继代培养时间对愈伤组织的分化有很大影响。从成熟胚诱导的愈伤组织分化能力最强，可以达到48％左右。短芒披碱草最佳分化培养基是1／2MS基本培养基无机盐+B5有机物+NAA0.5mg／L+KT0.01mg／L。优化了燕麦861再生体系：分析比较了该品种成熟胚，下胚轴和幼叶三种来源的外植体，其中成熟胚的出愈率最高，平均达到了64％。燕麦草愈伤组织诱导的最适培养基均为MS培养基，最佳的激素组合为4mg／L 2，4-D。从成熟胚诱导的愈伤组织分化能力最强，可以达到54.3％左右。燕麦最佳分化培养基是1／2MS基本培养基无机盐+B5有机物+0.1mg／LKT和1.0mg／L6—BA。建立了燕麦抗性愈伤组织的筛选方案。较好的筛选剂是潮霉素，45mg／L潮霉素浓度可较好的燕麦愈伤组织的筛选。确定使用成熟胚诱导出来的愈伤组织作为基因转化的材料，并通过根癌农杆菌介导，把类产碱假单胞菌的杀虫毒蛋白基因ppIP转入继代40d后的愈伤组织，用潮霉素筛选抗性愈伤组织，最后再生分化出抗性植株，筛选培养基配方为：MS+2，4-D5.0+KT0.05+Hn45+Carb500。实验所用质粒为PCAMBIA1304双元载体，其上有kam，hpt，gus和mGFP等基因，用特定的酶切去gus和mGFP基因，然后把杀虫毒蛋白基因ppIP连接上去。构建好的质粒转入根癌农杆菌EH105，然后浸染已经处理好的愈伤组织。农杆菌浸染后的愈伤组织培养在共培养基上，共培养6d后，转入筛选培养基筛选抗性愈伤组织，共培养基配方为：1／4MS+2，4-D5.0+80μMAS pH5.6最后通过PCR，RT-PCR来检测杀虫毒蛋白基因是否转入再生植株。愈伤组织的继代时间，农杆菌液的浸染浓度，共培养的时间和温度等因素都要影响农杆菌的转化。本实验对这些影响因素进行了优化，建立了燕麦转基因操作体系。