题目1携带MDR1基因的逆转录病毒载体的安全性研究目的:探讨携带MDR1基因的逆转录病毒载体在转染入小鼠骨髓单个核细胞(BM-MNCs)前后,转染MDR1基因的BM-MNCs回输或种植在小鼠体内后有无自我复制能力的逆转录病毒产生或致瘤性,为进一步临床应用提供安全性实验依据。方法: (1)收集产病毒包装细胞PA317-HaMDR1/A的细胞上清液,浓缩后用RT-PCR法检测MDR1和env基因的表达情况;(2)浓缩病毒上清液转染小鼠BM-MNCs后,RT-PCR法检测BM-MNCs中MDR1和env基因的表达情况;(3)20只BALB/c小鼠(经60Co-γ放疗预处理)随机分为两组,每组10只:实验组回输转染MDR1基因的BM-MNCs,对照组回输等量生理盐水,监测外周血白细胞计数变化情况;每月检测骨髓和外周血单个核细胞中MDR1和env基因的表达情况;(4)20只裸鼠随机分为两组,每组10只,实验组在裸鼠腋部皮下注射转染MDR1基因的BM-MNCs,对照组注射等量的生理盐水,观察注射部位有无肿块生成;监测外周血白细胞计数;RT-PCR法检测腋部皮下结缔组织、骨髓和外周血单个核细胞中MDR1和env基因的表达情况;HE染色、电镜检测裸鼠腋部皮下结缔组织结构有无改变。结果: (1)RT-PCR法在PA317-HaMDR1/A细胞浓缩的病毒上清液中检测到MDR1基因表达的特异性条带,未检测到env基因的表达条带;(2)RT-PCR法在转染的小鼠BM-MNCs中检测到MDR1基因的表达,未检测到env基因的表达;(3)实验组BALB/c小鼠外周血白细胞计数下降较对照组缓慢,在第7天白细胞计数开始回升,在12天后两组差异有显著性意义(P<0.05);RT-PCR法在实验组小鼠骨髓和外周血单个核细胞中均检测到MDR1基因的表达,未检测到env基因的表达;(4)两组裸鼠外周血白细胞计数未见明显异常,差异无统计学意义(P<0.05);RT-PCR法在裸鼠腋部皮下结缔组织、骨髓和外周血单个核细胞中均未检测到MDR1和env基因的表达;透射电镜在裸鼠腋部皮下结缔组织中未检测到逆转录病毒颗粒,结缔组织结构未见明显异常;病理HE染色见结缔组织形态结构无异常,未见病理性核分裂像。结论:病毒上清液及转染MDR1基因的BM-MNCs回输入体内前后均未检测到有复制能力的逆转录病毒产生;转染MDR1基因的BM-MNCs无致瘤性。题目2大剂量阿霉素化疗联合全反式维甲酸对肝癌小鼠的影响实验研究目的:维甲酸类化合物对多种恶性肿瘤具有诱导分化、抑制增殖、诱导凋亡等作用,是一类疗效确切的抗肿瘤药物。本研究将MDR1基因转染入骨髓单个核细胞(BM-MNCs)后回输入肝癌小鼠体内,观察阿阿霉素大剂量化疗联合应用全反式维甲酸(ATRA)后对肝癌组织生长、外周血白细胞计数、肝癌组织P-gp及增殖凋亡因子表达的影响,和外源性MDR1基因在体内的分布情况。方法:收集产病毒包装细胞PA317-HaMDR1/A的病毒上清液并浓缩,采用病毒上清转染法转染BALB/c小鼠BM-MNCs,RT-PCR法检测小鼠BM-MNCs中MDR1基因的表达情况;将40只肝癌荷瘤BALB/c小鼠随机分为5组:A正常对照组(不照射不回输),B空白对照组(照射并回输等量生理盐水),C阴性对照组(照射并回输未转染MDR1基因的BM-MNCs),D1联合用药组(照射并回输转染MDR1基因的BM-MNCs),D2阿霉素组(照射并回输转染MDR1基因的BM-MNCs),每组8只。B、C、D1组进行大剂量阿霉素化疗同时联合应用ATRA,D2组单用阿霉素大剂量化疗,每三天监测各组肝癌组织的大小、外周血白细胞计数变化情况,每周用FISH和RT-PCR法检测各组小鼠外周血和BM-MNCs、肿瘤组织和重要脏器中MDR1基因的表达和分布情况,每周用免疫组织化学法检测各组肝癌组织P-gp和增殖凋亡因子的表达情况。结果:(1)RT-PCR法证实外源性MDR1基因可有效地整合到小鼠BM-MNCs基因组中并进行转录表达;RT-PCR法在联合用药组D1和阿霉素组D2肝癌小鼠的外周血和BM-MNCs中均检测到MDR1基因的表达;(2)联合用药组D1组和阿霉素组D2组肝癌小鼠肿瘤组织的瘤重较对照组轻,化疗18天后差异有统计学意义(P<0.05);联合用药组D1组肝癌小鼠的肿瘤组织的瘤重总体较阿霉素组D2组的轻,但差异无统计学意义(P>0.05);(3)联合用药组D1组和阿霉素组D2组肝癌小鼠外周血白细胞计数高于两个对照组,化疗第2周后差异有统计学意义(P<0.01);联合用药组D1组和阿霉素组D2组肝癌小鼠外周血白细胞计数差异无统计学意义(P>0.05);(4)FISH和RT-PCR法在转染组小鼠小鼠重要脏器和肿瘤组织中均未检测到BM-MNCs和外源性MDR1基因定植和表达;(5)随着化疗剂量的增加,联合用药组D1组与阿霉素组D2组比较肝癌组织中P53、bax、PCNA和Ki-67表达的阳性率差异无统计学意义(P>0.05);化疗4周后联合用药组D1组肝癌组织中P-gp表达阳性率高于阿霉素组D2组,增高有统计学意义(P<0.05);化疗3周后联合用药组D1组肝癌组织Bcl-2的表达阳性率均高于阿霉素组D2组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)通过逆转录病毒载体可在体外将外源性MDR1基因转入小鼠BM-MNCs中,外源性MDR1基因转染回输后在小鼠骨髓和外周血单个核细胞有持续表达;(2)ATRA和阿霉素联用后不能增强或减弱阿霉素化疗的疗效,ATRA和阿霉素联用无协同或拮抗作用;(3)ATRA和阿霉素联用后与单用阿霉素比较,两者对骨髓造血功能的影响差异无统计学意义;(4)外源性MDR1基因转染移植后在小鼠重要脏器和肿瘤组织无表达;(5)全反式维甲酸能增加肝癌组织中P-gp表达的阳性率,增强了肝癌组织的耐药性,推测可能与上调抗凋亡因子Bcl-2的表达有关,而与增殖相关因子PCNA、Ki-67,凋亡相关因子P53、Bax的表达无直接关系。
