龙葵提取物澳洲茄碱对肺癌细胞的抑制作用研究

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龙葵分布广泛,是药食两用植物。他营养成分高,可食用;也有较好的药用价值,是一种常用于治疗肿瘤的中药;龙葵还具有分布广泛、炮制工艺简单、价格便宜、使用方便等优点。龙葵全草均可入药,其生物活性成分主要包括甾体类生物碱、多糖、维生素A和维生素C等;其中,甾体类生物碱中澳洲茄碱(Solasonine)和澳洲茄边碱(Solamargine)是龙葵的主要活性成分,它们水解后苷元是澳洲茄胺(Solasodine),具有抗肿瘤活性,因此龙葵被列为十大抗肿瘤中草药之一,是一种具有良好药用前景的治疗肿瘤天然药物。人肺腺癌细胞A549和小鼠Lewis肺癌细胞(Lewis Lung Carcinomas,llc)作为肺癌的细胞模型在肺毒理学的体外研究和抗癌作用的研究中得到广泛使用,已成为抗肺癌研究的重点领域之一。本研究采用MTT法检测了龙葵提取物澳洲茄碱对人类肺癌细胞株A549及小鼠lewis肺癌细胞株LLC的抑制效果;以稍高半致死剂量的澳洲茄碱分别处理两种肺癌细胞,并进行了细胞形态学观察;以稍高半致死剂量的澳洲茄碱处理A549细胞,并进行了AnnexinV/PI双染流式细胞分析和荧光定量PCR分析p53通路的下游因子Puma基因的表达;最后,采用MTT法比较了澳洲茄碱与其水解苷元澳洲茄胺(solasodine)之间在相同的实验条件下,抑制相同的两种肺癌细胞的药效作用。结果表明,澳洲茄碱对A549和LLC肺癌细胞均有明显的抑制作用,澳洲茄碱对两种肺癌的抑制作用基本上呈现与浓度成正比的趋势,并得出澳洲茄碱对A549和LLC的24小时IC50值分别为约18和20μg/mL;细胞形态学观察表明以终浓度为20μg/mL澳洲茄碱处理的A549细胞大多呈现细胞膜皱缩样的垂死形态;annexinV/PI流式细胞分析结果表明以20μg/mL澳洲茄碱处理24小时的细胞的总死亡率为42.43%((Q2+Q3)/(Q2+Q3+Q4)),其中,早期凋亡细胞占总死亡细胞约22.08%(Q3/(Q2+Q3)),晚期凋亡或晚期凋亡和坏死细胞约占77.92%(Q2/(Q2+Q3));SYBR绿色荧光定量PCR数据显示,澳洲茄碱的处理显著提高了A549癌细胞中p53通路的下游因子Puma基因的表达水平;澳洲茄胺对A549和LLC肺癌细胞均有明显的抑制作用,其抑制作用基本上呈现与浓度成正比的趋势,并得出澳洲茄胺对A549和LLC的24小时IC50值均约为7.5μg/mL。研究表明,澳洲茄碱能明显抑制肺癌细胞的生长,其方式主要是诱发细胞凋亡或细胞凋亡和细胞坏死,并且与p53通路中Puma表达水平大幅提高密切相关;澳洲茄碱水解导致苷元释放这一结构的改变提高了其抑制肿瘤细胞的药效效率,说明苷元部分是澳洲茄胺和澳洲茄碱抑制肺癌细胞生长的有效分子基团。
摘要第3-5页
ABSTRACT第5-6页
第1章 绪论第10-26页
    1.1 概述第10-11页
    1.2 龙葵第11-18页
        1.2.1 龙葵的种类及分布第11-12页
        1.2.2 龙葵成分第12-16页
        1.2.3 龙葵的应用第16-18页
    1.3 肺癌第18-22页
        1.3.1 肺癌的治疗第18-22页
    1.4 龙葵抑瘤成分及作用机制研究第22-24页
        1.4.1 龙葵生物碱的抑瘤作用机制第22-23页
        1.4.2 龙葵多糖的抑瘤作用机制第23页
        1.4.3 龙葵糖蛋白的抑瘤作用机制第23-24页
    1.5 本课题的研究意义及主要研究内容第24-26页
        1.5.1 研究意义第24页
        1.5.2 主要研究内容第24-26页
第2章 MTT 法检测澳洲茄碱对肺癌细胞的抑制作用第26-32页
    2.1 引言第26页
    2.2 材料与方法第26-29页
        2.2.1 实验材料和仪器设备第26页
        2.2.2 细胞株第26页
        2.2.3 药品与培养基第26-27页
        2.2.4 培养液及配制方法第27页
        2.2.5 细胞的复苏和冻存方法第27-28页
        2.2.6 仪器及设备第28页
        2.2.7 澳洲茄碱溶液的配制方法第28页
        2.2.8 细胞培养方法第28-29页
        2.2.9 细胞增殖抑制实验测定方法第29页
    2.3 结果第29-30页
    2.4 讨论第30-32页
第3章 AnnexinV/PI 双染流式细胞分析澳洲茄碱对肺癌细胞作用机制第32-38页
    3.1 引言第32页
    3.2 材料与方法第32-35页
        3.2.1 实验材料和仪器设备第32页
        3.2.2 细胞株第32页
        3.2.3 药品与培养基第32-33页
        3.2.4 培养液及配制方法第33页
        3.2.5 细胞的复苏和冻存方法第33-34页
        3.2.6 试剂盒第34页
        3.2.7 仪器及设备第34页
        3.2.8 细胞形态学观察方法第34页
        3.2.9 AnnexinV/PI 双染流式细胞分析办法第34-35页
    3.3 结果第35-36页
        3.3.1 细胞形态学观察结果第35页
        3.3.2 AnnexinV/PI 双染流式细胞分析结果第35-36页
    3.4 讨论第36-38页
第4章 澳洲茄碱对肺癌 A549 细胞中 p53 通路下游因子基因表达的影响第38-44页
    4.1 引言第38页
    4.2 材料与方法第38-41页
        4.2.1 实验材料和仪器设备第38页
        4.2.2 细胞株第38页
        4.2.3 药品与培养基第38-39页
        4.2.4 试剂与试剂盒第39页
        4.2.5 引物序列第39页
        4.2.6 仪器及设备第39页
        4.2.7 澳洲茄碱溶液的配制办法第39页
        4.2.8 细胞培养办法第39-40页
        4.2.9 细胞总 RNA 的提取方法第40页
        4.2.10 RNA 质量鉴定方法第40页
        4.2.11 细胞总 cDNA 的获取方法第40页
        4.2.12 SYBR 荧光定量 PCR 方法第40-41页
    4.3 结果第41-42页
        4.3.1 RNA 质量鉴定结果第41页
        4.3.2 SYBR 荧光定量 PCR 结果第41-42页
    4.4 讨论第42-44页
第5章 澳洲茄碱及其水解苷元澳洲茄胺的构效关系第44-49页
    5.1 引言第44页
    5.2 材料与方法第44-46页
        5.2.1 试剂、药品与仪器第44-45页
        5.2.2 细胞株第45页
        5.2.3 均一澳洲茄胺醇溶液的制备第45页
        5.2.4 MTT 法检测(同 2.2.8)第45页
        5.2.5 细胞形态观察第45-46页
    5.3 结果第46-47页
        5.3.1 MTT 法检测澳洲茄胺对两种肺癌细胞的抑制作用第46页
        5.3.2 细胞形态观察第46-47页
    5.4 讨论第47-49页
第6章 结论与展望第49-51页
    6.1 结论第49-50页
    6.2 展望第50-51页
参考文献第51-59页
致谢第59页
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