SELEX技术体外筛选单增李斯特菌适配子及其荧光快速检测方法的建立

目的：本文采用SELEX技术，以单核细胞增生李斯特菌为靶目标，筛选得到一组拥有高亲和力和高特异性的寡核苷酸适配子，并初步建立单核细胞增生李斯特菌的荧光快速检测方法。方法：1.以单核细胞增生李斯特菌为靶目标，人工合成两端为固定序列，中间含37个随机序列，全长为80nt长度的ssDNA文库。应用SELEX技术进行反复9轮筛选，得到一组高亲和力和高特异性的适配子群。为了减少ssDNA与其他细菌的交叉结合，在第5轮用蜡样芽孢杆菌进行反筛，在第7轮用英诺克李斯特菌进行反筛。利用地高辛-抗地高辛碱性磷酸酶显色系统检测各轮筛选产物与单核细胞增生李斯特菌的结合率。2.最后一轮的筛选产物进行扩增、纯化，克隆、测序。应用Chromas2软件分析适配子的测序峰图，DNA MAN软件对测序出来的适配子序列一级结构进行同源性分析，并用RNA Structure软件预测序列的二级结构。3.通过对适配子结合力和特异性检测，选取最佳的一条适配子，运用荧光结合机制来设计分别标记有FAM和TAMRA的两种荧光适配子，初步建立荧光标记适配子直接检测法（FLADA）。结论：1.随着筛选轮数的增加，筛选条件越来越严格，最终得到一组高亲和力和高特异性的适配子群，初步建立了SELEX体外筛选单核细胞增生李斯特菌适配子的技术。利用克隆技术成功的将筛选获得的适配子进行克隆，测序，并将得到的18条序列分为A、B、C三组。A组中的15条序列的随机区片段长度和预期片段的随机区长度一致，B组中2条序列的随机区片段短于预期片段的随机区长度，C组中的1条序列的随机区片段比预期的多了一个碱基。运用DNAMAN软件分析18条克隆适配子一级结构的同源性，除H09序列剩下的17条序列都有较高的同源性，说明经过9轮SELEX筛选，一级结构同源的适配子得到了一定程度的富集。应用RNA Structure软件模拟适配子的二级结构，以茎环结构为主。2.利用地高辛-抗地高辛碱性磷酸酶显色体系对适配子的结合率进行测定，从得到的18个克隆适配子中选取结合率最高的E01号适配子，并将E01号适配子与多种菌种结合，进行特异性检测，E01号适配子与目标菌单核细胞增生李斯特菌的结合力远远大于其他菌种，高达1.017，说明了E01号适配子的高特异性。3.选择FAM和TAMRA两种荧光基团对E01号适配子进行标记，荧光显微镜下可以直接观测到适配子与单核细胞增生李斯特菌孵育后有较强的荧光，而与蜡样芽孢杆菌和英诺克李斯特菌结合的数量就很少。荧光标记适配子与我们目标菌的检测灵敏度可达10~3/ml。初步建立了荧光基团标记适配子快速检测单核细胞增生李斯特菌的检测方法。