本论文的目的是研究几种病原菌口服疫苗接种鱼类的免疫效果,并从常见病原菌株中筛选几个具有较好保护效果的蛋白抗原,利用口服免疫的方式,接种养殖动物,并检测免疫效果。以10号白油为有机溶剂,采用搅拌与均浆方法制备鳗弧菌M3和SMP1的油乳化二价疫苗,用饵料包埋后以口服途径免疫养殖大菱鲆,评价免疫大菱鲆的免疫应答和疫苗的保护效果。结果显示,以油乳化和未油乳化疫苗分别连续口服免疫大菱鲆一周后,在后肠组织,乳化疫苗刺激产生的非特异性活力、特异性抗体水平均高于未乳化疫苗;而在血清,两种疫苗引起的两种酶的活力、SMP1抗体水平没有变化,但在乳化疫苗免疫的大菱鲆检测到明显高于未免疫对照大菱鲆的M3抗体水平。大菱鲆后肠组织原位杂交结果显示,口服免疫的大菱鲆后肠褶皱有IgM抗体的产生和分布。其中,乳化疫苗免疫大菱鲆的IgM抗体的产生和分布水平高于未乳化疫苗免疫的大菱鲆。攻毒实验显示,乳化疫苗免疫的大菱鲆对M3和SMP1的感染分别获得100%和50%的免疫保护率,而未乳化疫苗获得的免疫保护率分别为57.9%和0%,表明乳化疫苗比未乳化疫苗更有效地保护大菱鲆、抵抗病原的感染。在乳化疫苗免疫持续期的研究中,免疫的大菱鲆后肠在免疫后120天仍能检测到抗体效价,在免疫后90天还能观察到一定的免疫保护效果。免疫30天、60天、90天和120天的大菱鲆分别获得100%、66.7%、36.7%和13.3%的免疫保护力。以鳗弧菌M3和SMP1、链球菌CF、迟缓爱德华菌SMW7作为细菌抗原制备油乳化多价口服疫苗和轮虫携带疫苗,口服途径免疫养殖大菱鲆与大菱鲆初孵仔鱼。结果显示,在免疫大菱鲆后肠可检测到抗M3抗体水平的提高(P<0.05),而在其胆汁、鳃、中肠、体表黏液、前肠与血清中抗体效价变化与对照组没有显示出差异;没有检测到免疫大菱鲆后肠抗SMP1、SMW7、CF抗体效价。M3浸泡攻毒实验显示,口服免疫的大菱鲆获得了100%的免疫保护力;在M3注射攻毒和SMP1、CF、SMW7浸泡攻毒大菱鲆的实验中,在每个攻毒组中,免疫组大菱鲆开始死亡的时间都要比对照组有不同程度的延迟,但攻毒大菱鲆都发生死亡,不能显示出与对照组的差异。轮虫携带免疫的结果显示,免疫的大菱鲆初孵仔鱼并未获得较好的保护效果,与对照大菱鲆没有体现出差异。从致病性病嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)LSA34克隆并表达ahaI基因和gapA基因,从迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)LSE40克隆并表达eseB,将所得蛋白分别通过腹腔注射途径免疫大菱鲆,检测蛋白的免疫原性和免疫保护。结果在免疫后7天就可以检测到AhaI、GapA蛋白免疫组大菱鲆产生的抗体,至第40天可以检测到明显的保护性抗体,之后抗体效价增加明显,直至第60天时达到最高值。EseB免疫的大菱鲆第一次免疫后15天就有较高的抗体效价产生,明显高于对照组大菱鲆血清抗体效价,到距第一次免疫60天时,抗体效价达到最高值。攻毒实验显示,与对照组相比,AhaI免疫组和GapA免疫组对LSA34感染的免疫保护力分别为80%和100%;AhaI免疫组和GapA免疫组对LSE40感染的免疫保护力分别为30%和10%。,而对照组牙鲆对人工攻毒不具有保护力。以AhaI和GapA作为疫苗免疫大菱鲆,使大菱鲆获得了对嗜水气单胞菌LSA34较高的免疫保护;而对迟缓爱德华氏菌LSE40的交叉保护能力没有明显提高。EseB免疫的大菱鲆在攻毒实验中并没有显示出较好的保护效果,与对照组相比,只是在死亡时间上有所延迟。以从致病性嗜水气单胞菌中克隆的ahaI和gapA基因表达出的蛋白为蛋白抗原制备油乳化疫苗,用饵料包埋后以口服途径免疫养殖牙鲆,评价免疫牙鲆的免疫应答和疫苗的保护效果。结果显示,以油乳化和未油乳化疫苗分别免疫牙鲆一周后,在后肠组织,AhaI和GapA乳化疫苗免疫组牙鲆检测到抗体,且分别高于AhaI和GapA未乳化疫苗免疫的牙鲆;而在血清,GapA的两种疫苗引起的GapA抗体水平没有变化;但在AhaI乳化疫苗免疫的牙鲆第21天和第35天的血清中检测到高于未免疫对照牙鲆的AhaI抗体水平,AhaI未乳化疫苗免疫牙鲆血清对照组相比没有检测到AhaI抗体水平的变化。
