应用RNA干扰技术降低人胚胎心脏袓细胞免疫原性的实验研究

干细胞移植、组织工程等再生医学技术的临床应用，干细胞是基本要素和必备条件。异体来源的干细胞，伦理、排斥、安全等问题，限制了临床应用；自体来源的干细胞，难以进入产业化生产，制约临床广泛使用，不是再生医学理想之路。核转移（克隆）、诱导性干细胞（iPS）技术，是目前解决该难题的理想方案，但前者在人类尚未成功，后者遇到免疫排斥和安全问题等技术难关。基于免疫排斥反应是由细胞膜上免疫原性分子所决定的基本认识，本课题拟以人胚胎心脏祖细胞为胚胎源性干/祖细胞的代表，首先进行该细胞在未分化及加入IFN-γ、TNF-α模拟体内微环境的情况下，组织相容性抗原（移植抗原）表达情况的检测，确定胚胎源性干/祖细胞移植体内有无免疫原性；其次，利用基因芯片技术筛选与免疫原性密切相关的基因；最后，利用RNA干扰技术阻断所选基因，观测其降低免疫原性的可行性，旨在探讨胚胎源性干/祖细胞临床应用的可能性。第一部分HECPCs免疫原性及相关基因芯片检测目的：研究人胚胎心脏祖细胞（Human Embryo-derived Cardiac Progenitor Cells，HECPCs）免疫原性相关分子的表达，并通过基因芯片技术筛选出与HECPCs移植排斥反应关系密切的基因。材料和方法：1.取4-6周胚龄的人工流产胚胎，体外分离、培养HECPCs，应用流式细胞术检测HECPCs表面免疫原性分子表达情况，并观察在炎性细胞因子作用下免疫原性分子表达情况的变化；2.使用SBC（H1029）基因芯片检测炎性细胞因子刺激前后免疫相关基因的表达情况，初步筛选出表达明显上调、与免疫原性相关的重要基因，并用RT-PCR进行验证。结果：1.体外培养的HECPCs状态稳定，与原有细胞系性状一致，流式细胞术检测显示加入IFN-γ、TNF-α后HLA-I类分子表达明显升高，在5天时达到峰值，而HLA-DR类分子在各时间点均未见阳性表达；2.基因芯片结果显示，分别加入IFN-γ、TNF-α后两张芯片均上调的基因有116条、下调基因有122条，上调基因中明确与免疫调控有关的基因为57条，挑选其中4条上调幅度较大的基因进行验证，ASNS、IRF-1和MCP-3三条基因表达上调。结论：1. HECPCs作为再生医学中的种子细胞依然存在免疫原性问题；2.ASNS、IRF-1和MCP-3等基因可能与HECPCs免疫原性密切相关。第二部分siRNA干扰IRF-1基因及其对HECPCs免疫原性的影响目的：通过构建以IRF-1为靶点的RNA干扰慢病毒载体，降低HECPCs的IRF-1表达水平，从而获得IRF-1低表达细胞模型，并利单向混合淋巴细胞反应实验来检测其免疫原性的变化。材料和方法：1.以基因芯片初步筛选出的免疫原性相关基因干扰素调节因子（IRF）-1为靶点，构建慢病毒载体；2.应用Realtime-PCR和Western blot筛选干扰效果最佳的慢病毒载体进行RNA干扰实验；3.利用单向混合淋巴细胞反应实验检测RNA干扰IRF-1对HECPCs免疫原性的影响。结果：1.针对IRF-1不同序列，构建了Lenti-L1、Lenti-L2和Lenti-L3三个干扰载体；2.慢病毒感染72h后，Realtime-PCR检测Lenti-L1、Lenti-L2和Lenti-L3干扰IRF-1mRNA表达的干扰效率分别为74%、86%、71%，Western blot检测Lenti-L1、Lenti-L2和Lenti-L3干扰IRF-1蛋白表达变化的结果与Realtime-PCR结果一致，Lenti-L2的干扰效果最为明显；单向混合淋巴细胞反应显示，经RNAi处理后HECPCs刺激PBMCs增殖效果明显减弱，提示其免疫原性降低。结论：1. RNA干扰IRF-1表达可降低HECPCs的免疫原性；2.应用RNA干扰技术进行免疫原性相关基因修饰是降低胚胎源性干/祖细胞免疫原性、减轻移植排斥反应的一种可行方法。