目的:溶酶体跨膜蛋白 5(Lysosomal-associated protein transmembrane 5,Laptm5)主要表达于淋巴系和髓系来源的细胞,前期转录组芯片检测发现,癌基因c-myc激活时,B细胞淋巴瘤内Laptm5的表达明显降低,但Laptm5对小鼠B淋巴瘤的影响不清楚。本研究主要探讨小鼠Laptm5 3’非编码区(3’-untranslated region,3’UTR)通过影响miR-17-3p对靶蛋白的调控,发挥竞争性内源RNA(Competing endogenous RNA,ceRNA)作用,影响小鼠B细胞淋巴瘤生长的作用机制。方法:1、用qRT-PCR方法以及Western Blot技术检测小鼠B细胞淋巴瘤细胞株以及临床淋巴瘤组织中Laptm5和miR-17-3p的表达水平。2、构建 Laptm5 3’UTR 和 miR-17-3p 结合位点突变的 Laptm5 3’UTR(Laptm5 3’UTRmut)过表达质粒,包装得到病毒,分别感染小鼠B细胞淋巴瘤细胞株38B9细胞。细胞计数的方法检测各组细胞的增殖情况。用流式细胞仪检测细胞凋亡及周期变化。3、将过表达 Laptm5 3’UTR 和 Laptm5 3’UTRmut 以及空载体(pMSCV-PIG)的 38B9 细胞注射入小鼠皮下,构建荷瘤小鼠模型,观察肿瘤生长情况,并通过免疫组化技术检测肿瘤细胞增殖情况。4、将过表达Laptm5 3’UTR和空载体(pMSCV-PIG)的38B9细胞进行转录组芯片检测,可被Laptm5 3’UTR上调的mRNA与生物信息学检索的miR-17-3p靶基因取交集,选取Mlk1(Ablation of mixed lineage kinase 1,Mlk1)进行进一步研究。5、构建miR-17-3p过表达质粒及荧光素酶Laptm5 3’UTR融合基因质粒,用双荧光素酶报告基因检测系统观察miR-17-3p对Laptm5的靶向调节作用。Western Blot技术观察miR-17-3p对Laptm5及Mlk1蛋白的调控作用以及Laptm5 3’UTR对Laptm5蛋白及Mlk1蛋白的影响。6、分别用细胞计数及流式细胞技术检测过表达miR-17-3p的38B9细胞增殖及细胞周期情况,并通过荷瘤小鼠实验,观察miR-17-3p对肿瘤生长的影响。结果:1、在小鼠B细胞淋巴瘤中,Laptm5mRNA和蛋白的表达水平明显的低于正常B细胞(P<0.01),临床B细胞淋巴瘤标本中Latptm5mRNA水平显著低于炎症性淋巴结组织(P<0.01)。miR-17-3p在小鼠B细胞淋巴瘤细胞中高表达(P<0.01)。2、过表达Laptm53’UTR的小鼠B细胞淋巴瘤细胞增殖能力比过表达Laptm5 3’UTRmut和空载体的细胞显著降低(P<0.01);细胞周期实验显示过表达Laptm53’UTR的小鼠B细胞淋巴瘤细胞位于G1期的细胞数量显著多于过表达Laptm5 3’UTRmut和空载体的细胞((P<0.01));小鼠荷瘤实验结果显示Laptm53’UTR组肿瘤生长显著比Laptm53’UTRmut和空载体组慢(P<0.01)。3、双荧光素酶报告基因实验证实miR-17-3p可靶向负调节Laptm5 3’UTR,并抑制Laptm5蛋白的表达,但是不影响其mRNA的水平(P>0.05)。4、通过对过表达Laptm53’UTR的小鼠B细胞淋巴瘤细胞基因芯片检测及生物信息学检索,选取既受Laptm53’UTR上调又是miR-17-3p预测靶基因的Mlk1,进行实验验证,结果发现Mlk1蛋白水平同样受miR-17-3p的负调控,且在小鼠B细胞淋巴瘤中,Mlk1的表达水平与Laptm5 3’UTR的表达水平成正相关。当Laptm5 3’UTR过表达时,Mlk1和Laptm5蛋白的表达水平均升高,而Laptm5 3’UTRmut则对两者的表达无显著影响。5、细胞计数实验结果显示miR-17-3p可显著促进小鼠B细胞淋巴瘤细胞生长,小鼠荷瘤实验同样显示miR-17-3p具有促进B淋巴瘤生长的作用。结论:1、Laptm5在B细胞淋巴瘤中的表达显著降低,Laptm53’UTR可抑制小鼠B细胞淋巴瘤的生长;miR-17-3p在小鼠B细胞淋巴瘤细胞株中高表达,可促进小鼠B细胞淋巴瘤的形成。2、miR-17-3p可靶向负调控Laptm5的表达,Laptm5 3’UTR可作为Mlk1和Laptm5的ceRNA,通过竞争性结合miR-17-3p,减轻miR-17-3p对Mlk1及Laptm5的靶向抑制作用,从而调节小鼠B细胞淋巴瘤的形成。
