目前糖尿病在全世界患病人数已超过2.2亿。糖尿病的心血管风险已被广泛认知,例如冠心病和糖尿病心肌病。由于糖尿病患者具有较高的心律失常发生率,容易出现房颤、室颤甚至猝死,越来越多的研究开始关注糖尿病导致心律失常的发病机制。在心脏电机械活动中,心肌细胞之间的电偶联和有序的电传导依赖于缝隙连接的功能。许多研究提示缝隙连接表达或功能的变化会引起电传导的紊乱和心律失常的发生。因此,糖尿病患者中心肌细胞缝隙连接的变化可能与其心律失常并发症直接相关。目前认为,Cx43是心室肌细胞最主要的缝隙连接蛋白,而Cx40和Cx45在心房肌和传导系统中也有少量的表达。Cx43蛋白表达的变化或重分布将为各种心律失常提供致病基础。在糖尿病患者中,心血管并发症被认为主要是高血糖诱发的。然而,随着病程的发展,许多混杂因素比如晚期糖基化终产物(AGEs)和高脂血症逐渐出现,它们可能会引起与单一高血糖作用不一样的表现。最近的一些研究发现,在STZ诱导的糖尿病大鼠模型中,诱导3周后的大鼠心脏Cx43表达下降,而诱导12周后的Cx43表达增加。对于不一致的实验结果我们不能排除除了高糖以外,还有其他因素也能作用于Cx43的表达。所以,我们在本实验中将探讨单纯高糖对心肌细胞缝隙连接的影响及其机制,这在国内外尚缺乏相关报道。表没食子儿茶素没食子酸脂(EGCG),是绿茶提取物茶多酚的主要组成成分。近来发现EGCG在心血管疾病中有着广泛的保护作用。它能够改善缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡,改善心肌肥大和氧化应激。有研究发现它能保护糖尿病大鼠的胰腺β细胞。在MDCK细胞,EGCG能改善DMSO对Cx43的抑制效应。但是,少有报道提及EGCG对心肌细胞Cx43的作用及其机制。因此,基于上述考虑,我们在本研究中首先观察了高糖处理对心肌细胞缝隙连接蛋白的表达影响,然后探讨了EGCG共处理是否能改善高糖环境下心肌细胞缝隙连接的表达和功能,并研究了其作用机制。最后,我们在STZ诱导的早期糖尿病大鼠模型中,用EGCG干预后探讨其保护作用。1高糖环境对大鼠心肌细胞缝隙连接的影响及其机制目的：探讨高糖环境对大鼠心肌细胞缝隙连接的影响及其机制。方法：取2天龄SD乳鼠,分离心肌细胞培养,培养5天后予以30mM高糖处理。Western blot检测Cx43表达变化；realtime PCR观察Cx43mRNA的变化。划痕染料传输试验观察缝隙连接功能的改变。然后Western blot检测高糖干预后P.PKC/PKC.P.Erk/Erk.P.P38/P38.P.JNK/JNK等信号通路蛋白的变化。随后加入PKC抑制剂(GF109203X)和Erk抑制剂(PD98059)等信号通路抑制剂预处理心肌细胞30min后,再予以高糖干预,Westen blot检测Cx43表达的变化。结果：高糖干预后Cx43表达显著下降,72h达到平台期,缝隙连接功能也受到显著抑制。但Cx43mRNA未见改变。加入蛋白酶抑制剂leupeptin预处理30min后,高糖对Cx43的下调作用被逆转。高糖可呈时间依赖性的激活P-PKC和P-Erk,分别在7.5min和15min达到最高峰,随后回落,但对P-P38和P-JNK激活不明显。加入PKC和Erk抑制剂预处理后,PKC抑制剂可显著抑制高糖对Cx43的下调。结论：高糖环境下心肌细胞的Cx43蛋白表达显著下降,缝隙连接功能受到抑制,但Cx43mRNA未见改变。PKC途径可能参与了高糖对心肌细胞Cx43的下调。2EGCG对高糖下调的心肌细胞缝隙连接的作用以及相关机制目的：探讨EGCG共处理对高糖下调的心肌细胞缝隙连接的作用以及相关机制方法：取2天龄SD乳鼠,分离心肌细胞后予以高糖培养72h,并加入EGCG共处理(不同时间和不同浓度),Western blot、realtime-PCR阳免疫荧光检测心肌细胞缝隙连接蛋白的表达。划痕染料传输实验观察缝隙连接功能的改变。Western blot检测EGCG对信号通路蛋白表达的影响,随后加入相应信号通路抑制剂预处理30min,观察EGCG对Cx43表达的影响。结果：EGCG呈时间依赖和浓度依赖的改善高糖对心肌细胞Cx43蛋白表达的下调,以40μM和24h共处理效果最明显；划痕染料传输实验提示EGCG共处理24h后被高糖抑制的缝隙连接功能得到改善。但EGCG和高糖对Cx40和Cx45均无明显作用,对Cx43mRNA的表达也无显著改变。Western blot提示EGCG (?)(?)激活P-Erk、 P-P38、 P-JNK,在15min到达高峰,但对P-PKC无明显激活作用。加入相应的信号通路抑制剂预处理30min后,发现P38抑制剂(SB203580)能抑制EGCG对Cx43的保护作用。结论：EGCG能显著改善高糖对心肌细胞Cx43的下调作用,恢复缝隙连接功能。P38MAPK途径可能参与了EGCG对心肌细胞Cx43的保护作用。3EGCG对早期糖尿病大鼠心肌细胞缝隙连接蛋白的影响目的：探讨EGCG对早期糖尿病大鼠心肌细胞缝隙连接蛋白的影响。方法：取SD健康雄性大鼠,一次性腹腔注射STZ60mg/kg诱导糖尿病模型,分为正常对照组,糖尿病组,糖尿病加EGCG干预组(50mg/kg/d, ig)。21天后免疫组化观察心肌细胞Cx43蛋白的表达改变和分布。结果：早期糖尿病大鼠的心肌细胞Cx43表达减少,呈颗粒状散在分布,失去连贯结构,而EGCG干预后表达得到明显改善,分布向闰盘集中,结构有序连贯。结论：EGCG能显著改善早期糖尿病大鼠心肌细胞Cx43的下调,并使其分布趋于正常。
