斑马鱼Clusterin基因的克隆、表达及调控研究和成肌细胞中IGFs表达调控机理的初步研究

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(1)Clusterin是一种普遍存在的、高度保守的异源二聚体硫酸化糖蛋白,该蛋白广泛表达于机体许多组织中,不仅与多种生物过程相关,而且与多种病理状态有关。最近的全基因组关联分析(Genome-wide association study, GWAS)结果表明Clusterin基因与阿兹海默病的病因学相关。然而,关于Clusterin基因的体内功能以及其在阿兹海默病病理中的作用却了解的很少。尽管人们利用多种哺乳动物细胞系在体外进行了大量关于Clusterin可能的细胞作用研究,但是对于Clusterin蛋白的体内生理功能还不清楚。基因敲除Clusterin的小鼠发育和生存都很正常,Clusterin基因在早期发育中的功能至今还是个未解决的重要问题。在该研究中,我们克隆得到了斑马鱼的Clusterin基因,并且确定了其结构上的保守性、在发育中的表达模式及其生理调控。斑马鱼的Clusterin基因和蛋白与人的直向同源基因Clusterin相似。生化方法测定表明斑马鱼Clusterin属于分泌型蛋白,并且不能与IGFs直接结合。在成年斑马鱼的很多组织中都能检测到Clusterin mRNA的表达。在斑马鱼早期发育中,从12hpf开始检测到Clusterin mRNA的表达,并且其表达水平在此之后逐渐增加。整胚原位杂交分析表明Clusterin mRNA在发育中的间脑脉络丛和中脑脉络丛中特异性地表达。在我们检测的各种胁迫中,热激胁迫能够增加Clusterin mRNA的表达水平,但是缺氧和离子胁迫却不能改变Clusterin mRNA的表达水平。在斑马鱼早期发育中,抑制IGF-1受体介导的信号通路或者过表达IGF配体都不能改变Clusterin mRNA的表达水平。与之对比,特异性地抑制或者基因敲降Notch信号通路后,Clusterin mRNA在脉络丛中的表达水平显著提高。这些结果表明在斑马鱼胚胎和幼体中Clusterin是脉络丛的一个标记基因,并且其在脉络丛中的表达受到Notch信号通路的调控但不受IGF信号通路的调控。(2)类胰岛素生长因子(IGF)信号系统是一个进化上相对保守的信号途径,在多种脊椎动物和细胞系中的研究表明,IGF信号系统在调节骨骼肌的生长、分化和维持成体肌肉组织的动态平衡中起着关键的作用。近年来,虽然人们已经对肌原分化中IGFs的表达和功能展开了较为深入的研究,并且研究表明IGFs具有治疗肌肉相关性疾病(如肌肉萎缩、肌肉营养失调和神经肌肉疾病等)的潜力,但是一直以来缺少外源性IGFs对内源性IGFs表达调控方式及其机制的研究。我们利用肌肉分化模式细胞--C2C12成肌细胞的优势,在该方面进行了研究。首先,我们通过向C2C12细胞中外源性地加入IGF-2蛋白,得出了外源性IGF-2以相反的方式调控内源性IGF-1和IGF-2 mRNA表达的结论:分别降低和提高内源性IGF-1和IGF-2 mRNA的表达水平;并且该调节方式具有时间依赖性。随后通过insulin、IGF-1和IGF-2的剂量反应效应实验我们推测得出IR、IGF-1R和杂合受体都可能参与了该介导作用,并且IR可能起主要作用。进一步通过对其下游相关信号通路进行特异性地抑制以及结合过表达实验的辅助,我们得出多条下游信号途径参与了该过程的结论。
摘要第5-7页
Abstract第7-8页
第一章 引言第11-43页
    1.1 Clusterin (丛生蛋白)的研究进展第11-28页
        1.1.1 简介第11-13页
        1.1.2 Clusterin:一个基因、两种转录本异构体和多种蛋白质亚型第13-18页
        1.1.3 Clusterin 的表达调控第18-20页
        1.1.4 Clusterin 的功能第20-25页
        1.1.5 Clusterin 与疾病第25-28页
    1.2 类胰岛素生长因子(Insulin-like Growth Factor, IGF)信号系统的研究进展第28-37页
        1.2.1 类胰岛素生长因子(IGFs)第29-30页
        1.2.2 IGF-1 型受体第30-31页
        1.2.3 IGF-2 型受体第31-32页
        1.2.4 IGF 结合蛋白(IGFBP)第32-33页
        1.2.5 IGFBPs 的生物学功能第33-35页
        1.2.6 IGF 信号系统在骨骼肌生长和分化中的作用第35-37页
    1.3 胰岛素受体家族简介第37-38页
    1.4 斑马鱼第38-39页
    1.5 小鼠C2C12 成肌细胞是研究肌肉分化的模式细胞第39-40页
    1.6 立题依据和研究意义第40-43页
        1.6.1 斑马鱼Clusterin 基因的克隆、表达及调控研究第40-41页
        1.6.2 成肌细胞中IGFs 表达调控机理的初步研究第41-43页
第二章 斑马鱼Clusterin 基因的克隆、表达及调控研究第43-81页
    2.1 前言第43-44页
    2.2 材料与方法第44-62页
        2.2.1 实验材料第44-45页
        2.2.2 主要仪器第45页
        2.2.3 主要化学和生物试剂第45-46页
        2.2.4 实验方法第46-62页
    2.3 实验结果第62-77页
        2.3.1 斑马鱼Clusterin 基因的克隆及序列分析第62-67页
        2.3.2 斑马鱼Clusterin 的基因组结构和共线性分析第67-68页
        2.3.3 斑马鱼Clusterin 的亚细胞定位和与IGFs 的结合情况第68-70页
        2.3.4 斑马鱼Clusterin 的表达谱分析第70-73页
        2.3.5 斑马鱼胚胎中Clusterin 表达的生理调控第73-75页
        2.3.6 斑马鱼胚胎中Clusterin 表达的激素调控第75-77页
    2.4 讨论第77-81页
第三章 成肌细胞中IGFs表达调控机理的初步研究第81-107页
    3.1 前言第81-82页
    3.2 材料与方法第82-90页
        3.2.1 实验材料第82-84页
        3.2.2 主要仪器和试剂第84-85页
        3.2.3 实验方法第85-90页
    3.3 实验结果第90-102页
        3.3.1 外源性IGF-2 对成肌细胞中内源性IGFs mRNA 表达水平的影响第90-92页
        3.3.2 成肌细胞中胰岛素受体家族成员表达情况分析第92-93页
        3.3.3 成肌细胞中,IGFs mRNA 的表达水平对外源性生长因子(In/IGFs)的剂量反应效应第93-96页
        3.3.4 成肌细胞中,PI3K、FRAP/mTOR、MEK1/2 和P38 MAPK 抑制剂及Akt 和mTOR 过表达载体的有效性验证第96-98页
        3.3.5 调节内源性IGFs 表达的可能下游信号通路第98-102页
    3.4 讨论第102-107页
总结第107-110页
展望第110-112页
参考文献第112-132页
附录第132-133页
致谢第133-134页
个人简历第134-135页
发表的学术论文第135页
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