通过红鲫(♀)(Carassius auratus red var.)和鲤鱼(♂)(Cyprinus carpio L.)属间远缘杂交,在其后代成功培育出了异源四倍体鲫鲤群体,目前已繁殖了19代(F3-F21)。该群体两性可育,遗传性状稳定,为探讨鱼类多倍体的形成提供了重要研究模型,为多倍体进化的相关遗传和表观遗传研究提供了良好的实验材料。以雄性异源四倍体鲫鲤与雌性二倍体日本白鲫(Carassius cuvieri)的倍性杂交形成了不育的三倍体湘云鲫。该三倍体、四倍体鱼的形成为开展不同倍性鱼的生物学比较研究提供了重要的生物学平台。不改变DNA序列而能影响生物体基因表达与表现型的表观遗传效应,对杂交多倍体生物的形成与进化适应具有重要的调控作用。DNA甲基化是表观遗传调控的最主要方式,进行异源四倍体鲫鲤及其亲本,红鲫和鲤鱼的DNA甲基化研究,探讨异源四倍体鱼与亲本相比所发生的DNA甲基化模式的变化,甲基化水平增加或降低的程度,甲基化对相关序列的修饰等内容,有助于了解杂交四倍体鱼形成所经历的表观遗传效应。另外,在已有的有关不同倍性鱼育性研究的基础上,本文开展了促性腺激素FSH和LH的两类旁分泌调节物质,活化素Activin及卵泡抑素Follistatin基因的分子克隆及序列分析,为进一步从遗传学角度探讨三倍体湘云鲫不育和四倍体鲫鲤可育的机制奠定了基础。本论文的研究结果如下：1.利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)方法分析了红鲫、鲤鱼和异源四倍体鲫鲤的DNA胞嘧啶甲基化模式。根据条带的位置和有无情况,显示在变性聚丙烯酰胺凝胶上的甲基化条带呈4种不同模式：非甲基化(CCGG)模式；内胞嘧啶全甲基化(CmCGG)模式；外胞嘧啶半甲基化(mCCGG)模式；还有一种模式在MspI和HpaII的泳道中都没有条带,该位点上可能所有胞嘧啶都被甲基化,内胞嘧啶半甲基化或外胞嘧啶全甲基化,或表示生物体该处没有CCGG位点(遗传突变的结果)。2.对聚丙烯酰胺凝胶上共355组多态性条带进行了深入分析。其中异源四倍体鲫鲤从双亲两方或一方继承的甲基化模式为61.69%,显示在鲫鲤系列中的甲基化水平主要遵循孟德尔遗传规律,并维持了这些甲基化模式在四倍体世代间的稳定性。相对于亲本,四倍体鲫鲤CCGG位点上也发生了一定的甲基化模式变异,并且其甲基化程度升高的比例最高。甲基化地位统计的结果也反映出异源四倍体鲫鲤系列中所发生的甲基化修饰增多。3.选取了19个在异源四倍体鲫鲤及亲本中显示出甲基化模式变化的片段进行了测序,其中11个与斑马鱼或其他鱼类中的某些基因组区域具有相似性,主要包括与细胞代谢或细胞周期调控有关的基因和少数重复序列。该结果说明DNA甲基化可能正是通过这些序列对异源四倍体鲫鲤的基因表达进行调控,并进一步影响表现型。本论文首次从表观遗传学的角度对异源四倍体鲫鲤的分子生物学特征进行了研究。说明DNA甲基化参与了异源四倍体鱼基因组及基因序列调控,从而控制发育并有利于该杂交多倍体群体的稳定和进化。4.对不同倍性鲫鲤Follistatin基因和Activin βB基因cDNA全长进行了克隆及序列分析。序列比对分析表明该两基因氨基酸序列在鲤科鱼类或与其他脊椎动物的比较中相似性都比较高,说明Follistatin和Activin β B蛋白在蛋白功能与进化上具有较高的保守性。该结果提示Follistatin和Activin在不同倍性鱼育性调控网络中的作用应该是通过转录水平和(或)转录后水平来行使的,可能与基因的剂量表达有关。
