雷帕霉素对内皮祖细胞数量和功能的影响及其水飞蓟素的保护作用
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研究目的通过动员外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)到血管局部或通过移植体外培养的EPCs修复损伤内皮成为治疗缺血性疾病的新策略之一。雷帕霉素涂层支架可抑制PCI术后的血管平滑肌DNA合成和增殖,起到防治再狭窄的作用,但其对血管再内皮化的抑制及血栓形成影响了支架置入患者的长期预后,其对血管再内皮化的抑制作用包含了对内皮细胞本身的迁移抑制,也可能与支架置入后雷帕霉素抑制EPCs迁移、增殖、整合入血管内膜作用相关。最近的研究发现,水飞蓟素可以抑制EPCs的衰老,并减少雷帕霉素对EPCs的抗增殖作用,但水飞蓟素是否也能改善雷帕霉素对EPCs的其他抑制作用还不清楚。基于以上研究现状,我们通过体外培养、鉴定EPCs,进一步研究雷帕霉素和水飞蓟素各自对EPCs增殖、迁移和凋亡的影响,并通过研究水飞蓟素对雷帕霉素干预下EPCs的多种保护作用,为进一步优化EPCs治疗药物洗脱支架植入后内膜修复延迟,减少血栓发生事件等提供重要的理论依据。研究方法1、EPCs的分离、培养和鉴定:密度梯度离心法分离、培养、鉴定得到EPCs,鉴定方法包括形态学、流式细胞仪测细胞分子标志物(CD34、CD133和KDR)和激光共聚焦倒置显微镜下观察培养细胞摄取ac-LDL和结合UEA-I的功能。2、雷帕霉素对EPCs数量和功能的影响:分别在EPCs中加入不同浓度雷帕霉素(0、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)干预24小时和加入雷帕霉素(1ng/ml)干预不同时间(0小时、6小时、12小时、24小时、48小时),收集细胞检测增殖和迁移能力。3、水飞蓟素对EPCs数量和功能的影响:在EPCs中加入不同浓度水飞蓟素(0、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)干预24小时后,收集细胞检测增殖、迁移和凋亡水平。4、水飞蓟素对雷帕霉素干预下EPCs的保护作用的检测:在EPCs中同时加入雷帕霉素(1ng/ml)和不同浓度水飞蓟素(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)干预24小时后,收集细胞检测增殖、迁移、凋亡和体外血管生成能力。5、统计学处理方法:数据以均数±标准差(X±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,方差齐性用SNK方法比较;方差不齐用Dunnett’s方法比较。数据用SPSS18.0统计软件进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1、EPCs鉴定:培养24小时后,部分细胞贴壁,3天后,大部分细胞贴壁,可见有集落形成,细胞呈圆形;7天后细胞呈梭形改变;9天左右细胞基本铺满培养板孔底即可消化传代。培养第7天的细胞经流式细胞仪检测CD34、CD133、KDR均呈阳性表达,表达率分别为:(35.5±4.6)%、(18.4±3.8)%、(88.6±5.1)%。通过共聚焦显微镜观察,细胞既能摄取DiI-Ac-LDL,也能结合FITC-UEA-I,两者均摄取的双染色阳性细胞呈黄绿色,阳性率达80%以上,证实培养的细胞是正在分化的EPCs。2、雷帕霉素对EPCs数量和功能的影响:与对照组比较,雷帕霉素(1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)能抑制EPCs的增殖和迁移功能,并随干预浓度的增加和干预时间的延长而增加(n=6,P<0.05)。3、水飞蓟素对EPCs数量和功能的影响:与对照组比较,水飞蓟素干预24小时后,25μg/ml的水飞蓟素可以增加EPCs的增殖和迁移能力,但没有达到统计学显著差别(n=6, P>0.05);随着浓度的增加,50μg/ml的水飞蓟素和100μg/ml的水飞蓟素可以明显增加EPCs的增殖和迁移能力(n=6, P<0.05),其中50μg/ml和100μg/ml的水飞蓟素都明显增加了EPCs的增值能力,但两者之间没有达到统计学明显差异(n=6, P>0.05)。在凋亡的检测中,25μg/ml~100μg/ml的水飞蓟素都可以明显抑制EPCs的凋亡(n=6, P<0.05),并呈浓度依赖性。4、水飞蓟素对雷帕霉素干预下EPCs的保护作用观察:EPCs在加入雷帕霉素(1ng/ml)和不同浓度水飞蓟素(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)共同干预24小时后,25μg/ml的水飞蓟素就可以改善雷帕霉素对EPCs的抑制作用,但没有达到统计学明显差异(n=6, P>0.05),随着水飞蓟素浓度的增加,50μg/ml的水飞蓟素和100μg/ml的水飞蓟素都可以明显改善雷帕霉素对EPCs的促凋亡作用,并能逆转雷帕霉素对EPCs增殖、迁移和血管形成能力的抑制作用(n=6, P<0.05),其中100μg/ml的水飞蓟素和50μg/ml的水飞蓟素相比,虽然EPCs的增殖活性和迁移活性也有增加,但没有达到统计学明显差异(n=6, P>0.05)。研究结论1、雷帕霉素能抑制EPCs的增殖和迁移能力,并呈浓度和时间依赖性。2、水飞蓟素能增强EPCs的增殖和迁移能力,抑制其凋亡,并呈浓度依赖性。3、水飞蓟素能抑制雷帕霉素对EPCs的促凋亡作用,并能逆转雷帕霉素对EPCs增殖、迁移和血管形成能力的抑制作用。
摘要 | 第7-9页 |
Abstract | 第9-10页 |
主要英文缩略词表 | 第11-13页 |
前言 | 第13-16页 |
第一部分 人外周血内皮祖细胞培养和鉴定 | 第16-25页 |
一、材料和试剂 | 第16-17页 |
二、实验方法 | 第17-19页 |
三、结果 | 第19-21页 |
四、讨论 | 第21-22页 |
参考文献 | 第22-25页 |
第二部分 雷帕霉素对内皮祖细胞数量和功能的影响 | 第25-35页 |
一、材料和试剂 | 第25-26页 |
二、实验方法 | 第26-27页 |
三、结果 | 第27-31页 |
四、讨论 | 第31-32页 |
参考文献 | 第32-35页 |
第三部分 水飞蓟素对内皮祖细胞数量和功能的影响 | 第35-44页 |
一、材料和试剂 | 第35-36页 |
二、实验方法 | 第36-37页 |
三、结果 | 第37-41页 |
四、讨论 | 第41-42页 |
参考文献 | 第42-44页 |
第四部分 水飞蓟素对雷帕霉素干预下 EPCs 的保护作用 | 第44-59页 |
一、材料和试剂 | 第44-45页 |
二、实验方法 | 第45-47页 |
三、结果 | 第47-54页 |
四、讨论 | 第54-55页 |
参考文献 | 第55-59页 |
综述 内皮祖细胞与支架术后再内皮化的研究进展 | 第59-67页 |
参考文献 | 第64-67页 |
在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 | 第67-68页 |
致谢 | 第68页 |
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