文蛤弧菌病的病原分析、免疫应答及抗性选育研究

文蛤(Meretrix meretrix)是我国沿海重要的经济贝类,是我国沿海开发滩涂、发展贝类养殖的理想对象,具有广阔的市场前景和较高的经济价值。与其他养殖贝类一样,文蛤养殖产业也正在面临着病害带来的负面影响,造成了较为严重的经济损失。开展贝类抗性品种的培育,是应对养殖病害、实现健康养殖的重要途径。从病原致病机理和宿主免疫防御机制等方面开展系统研究,能够为贝类抗性选育提供理论基础和科学方法。本研究通过对从2007年江苏沿海文蛤病害中所取文蛤样品的细菌分离、鉴定以及致病力分析发现,菌株MM21(副溶血弧菌)及MM5(类弗尼斯弧菌)能够引起文蛤较高的致死率,通过观察感染文蛤各组织的组织病理学变化以及细胞病理学变化发现,菌株MM21和MM5能够引起文蛤肝胰腺、鳃、外套膜等组织的病理学损伤,如脂滴增多、代谢紊乱、分泌加剧、颗粒沉积以及感染弧菌的入侵等。致病性以及致病机理的研究证明,弧菌属细菌是文蛤的重要致病菌,尤其是副溶血弧菌能够引起文蛤的高致死率。从宿主免疫角度出发,分别分析了弧菌感染后文蛤中免疫直接效应因子i型溶菌酶以及免疫间接效应因子热休克蛋白70的免疫应答变化。结果显示,弧菌刺激后文蛤肝胰腺和鳃中i型溶菌酶的mRNA表达量以及蛋白表达量都显著上升,另外文蛤i型溶菌酶重组蛋白对弧菌具有抗菌活性,进一步证明i型溶菌酶在文蛤抗弧菌免疫中发挥作用;同样地,弧菌刺激后文蛤肝胰腺和鳃中热休克蛋白70的mRNA表达量以及蛋白表达量也显著上升,说明热休克蛋白参与文蛤抗弧菌免疫。因此,i型溶菌酶以及热休克蛋白70能够作为反映文蛤健康状况的参数并作为候选分子标记应用于弧菌抗性文蛤品系的选育。选择抗弧菌作为育种目标,采用攻毒实验结合群体内选育的方法进行了抗性文蛤品系的选择育种,获得了抗性文蛤的亲本群体并繁育了抗性文蛤的F1子代。以致死率为表型指标的评估显示,抗性文蛤F1子代的弧菌致死率显著低于对照群体,说明抗性文蛤F1子代获得了对弧菌增加的抗性。利用已获得的弧菌抗性文蛤遗传材料对i型溶菌酶基因中存在的单核苷酸多态性(SNP)进行了研究,对不同SNP与抗性的相关性分析发现,在所检测的i型溶菌酶SNP中,10个SNP位点与文蛤抗性呈显著相关,不同基因型的文蛤平均体重存在显著差异,抗性群体相较对照群体具有独特的优势单倍型。另外这10个SNP位点与文蛤体重具有相关性。以上分析说明,i型溶菌酶中的SNP标记与文蛤抗弧菌性状相关,能够作为文蛤抗弧菌的潜在分子标记应用于弧菌抗性文蛤的选育。