AKT活化的肿瘤细胞中HIF-1清除ROS的机制研究

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本研究拟明确丝氨酸/苏氨酸蛋白酶(serine/threonine protein kinase, AKT)活化的肿瘤细胞中缺氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor-1, HIF-1)对线粒体氧化呼吸和活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)生成的作用,并深入揭示HIF-1对叉头转录因子(forkhead transcription Factor, FOXO)转录因子的调控机制和其他ROS还原剂的作用。通过对上述机制的研究,评估HIF-1抑制剂和ROS诱导剂联合治疗AKT活化的胰腺癌的效果。我们首先观察到在胰腺癌组织中HIF-1的表达与预后相关,其蛋白表达强弱与临床分期及淋巴结转移等正相关,从而验证了HIF-1可能做为新的胰腺癌治疗靶点。AKT的活化可在常氧下引起细胞内HIF-1表达的上调,肿瘤过度生长细胞耐受乏氧时也存在HIF-1的表达增加,因而我们在常氧下对AKT活化的肿瘤细胞中ROS的代谢进行研究,就可以明确HIF-1是否参与ROS的代谢及其机制。利用已建立的过表达质粒载体和干扰慢病毒载体,我们在胰腺癌细胞系Bx-PC3和Mia-Paca2中分别对HIF-1进行过表达和干扰,进而一方面利用流式细胞术测定细胞内ROS含量的变化,另一方面测定HIF-1表达改变后,FOXO1及相应ROS还原系列基因的mRNA和蛋白的表达变化,同时采用染色体免疫共沉淀(CHIP)方法了解HIF-1与FOXO1启动子的结合方式,并利用双荧光素酶分析启动子功能。我们发现在低表达HIF-1的胰腺癌细胞系Bx-PC3中过表达HIF-1可导致细胞内ROS的减少,而在高表达HIF-1的胰腺癌细胞系Paca-2中干扰HIF-1的表达可导致细胞内的ROS累积。进一步的研究发现HIF-1清除ROS是通过与FOXO1启动子区的HRE直接结合从而正调控FOXO1及其下游ROS还原相关酶系的表达来完成,这通过在Bx-PC细胞系中过表达HIF-1载体与FOXO1的SiRNA共转染得以验证。在证实HIF-1对细胞内ROS具有清除作用及明确其机制后,我们应用HIF-1抑制剂和ROS诱导剂在体外进行了抗肿瘤治疗的实验研究。2ME为小分子HIF-1抑制剂,已为FDA批准用于临床。As203是常用的ROS诱导剂,已应用于白血病和肝癌的治疗。在体外研究中,我们首先用MTT实验确定二者单独作用于胰腺癌细胞时的IC50,进而利用MTT法确定不同组合比例的两种药物联合使用时的协同指数,通过流式细胞术明确2ME和As203联合可协同促进肿瘤细胞凋亡。为明确二者协同机制,我们分别用流式细胞术测定细胞内ROS含量、流式细胞术测细胞周期变化以及免疫荧光显像观察2ME单药,As2O3单药及二者联合用药时细胞内微管结构相应的变化。我们发现MTT法测定的2ME和As2O3的协同指数约0.2-0.5,因而具有很强的协同作用,联合用药细胞凋亡的比率显著增加。进一步探讨协同机制时我们发现,2ME和As2O3联合用药时细胞内ROS累积显著高于单药;单药As2O3虽不能引起明显的周期阻滞,但可显著增强2ME的细胞周期阻滞作用;再次,As2O3单药并不能引起微管解聚,但可显著增强2ME的微管解聚作用。综上,HIF-1可作为胰腺癌治疗的新的靶点,由于HIF-1参与细胞内ROS的降解,应用HIF-1抑制剂和ROS诱导剂在体外具有协同抗肿瘤作用。进一步的研究可进行2ME和As2O3联合治疗的体内试验,还可采用2ME和细胞毒药物组合或者As2O3与细胞毒药物联合对实体瘤进行治疗的实验研究。
中文摘要第4-6页
Abstract第6-7页
缩略语/符号说明第10-11页
前言第11-16页
    研究现状、成果第11-14页
    研究目的、方法第14-16页
一、HIF-1在胰腺癌中的表达及其临床病理学意义第16-24页
    1.1 对象和方法第16-20页
        1.1.1 病例资料第16页
        1.1.2 主要试剂第16-17页
        1.1.3 仪器第17页
        1.1.4 实验方法第17-20页
    1.2 结果第20-21页
        1.2.1 HIF-1α蛋白在PDAC组织中的表达第20页
        1.2.2 HIF-1α蛋白的表达与临床病理关系第20-21页
    1.3 讨论第21-23页
    1.4 小结第23-24页
二、HIF-1清除ROS的机制研究第24-50页
    2.1 对象和方法第24-42页
        2.1.1 主要试剂第24-26页
        2.1.2 仪器第26-27页
        2.1.3 实验方法第27-42页
    2.2 结果第42-48页
        2.2.1 HIF-1α过表达载体和干扰载体的鉴定第42-43页
        2.2.2 Paca-2中干扰HIF-1α后与ROS代谢相关基因的变化及蛋白表达的变化第43-44页
        2.2.3 Bx-PC3中过表达HIF-1α后与ROS代谢相关基因的变化及蛋白表达的变化第44-45页
        2.2.4 干扰或过表达胰腺癌细胞系的HIF-1α后细胞内ROS含量的变化第45-46页
        2.2.5 染色体免疫共沉淀第46-48页
        2.2.6 双荧光素酶分析第48页
    2.3 讨论第48-49页
    2.4 小结第49-50页
三、HIF-1抑制剂和ROS诱导剂抗肿瘤的体外研究第50-67页
    3.1 对象和方法第51-57页
        3.1.1 主要试剂第51-52页
        3.1.2 仪器第52页
        3.1.3 实验方法第52-57页
    3.2 结果第57-61页
        3.2.1 2ME和As_2O_3单药均可抑制胰腺癌细胞系生长,改变HIF-1表达水平可影响胰腺癌细胞的药物敏感性第57-58页
        3.2.2 2ME和As_2O_3联合使用对胰腺癌细胞系具有协同抗肿瘤作用第58页
        3.2.3 2ME和As_2O_3的协同作用与细胞内ROS累积相关第58-59页
        3.2.4 2ME和As_2O_3的协同作用与促进细胞凋亡相关第59-60页
        3.2.5 2ME和As_2O_3的协同作用与细胞周期阻滞相关第60-61页
        3.2.6 2ME可促进微管解聚,As_2O_3可增强2ME的微管解聚作用第61页
    3.3 讨论第61-66页
    3.4 小结第66-67页
全文结论第67-68页
论文创新点第68-69页
参考文献第69-76页
发表论文和参加科研情况说明第76-78页
综述第78-88页
    参考文献第83-88页
致谢第88页
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