目的:沙门菌(Salmonella)是寄生在人和动物肠道内可引起多种疾病的肠道致病菌,主要经水和食物传播。沙门菌质粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene,spv)与细菌毒力密切相关,其毒力表型主要由三个区域介导,包括调节基因spv R、效应基因spv B和spv C。文献报道spv B的编码产物具有ADP核糖基转移酶活性,可诱导细胞骨架解聚。本课题组前期研究发现spv B可抑制宿主细胞自噬体的形成,但相关的分子机制尚不清楚。本研究第一部分以人宫颈癌上皮细胞He La(human epithelial cell line)为感染模型,通过自噬通量和自噬体形成过程与细胞骨架的相互作用为研究点,探究spv B影响自噬体形成的分子机制。第二部分建立斑马鱼感染模型,深入研究在动物体内spv B基因对沙门菌感染后肠道上皮细胞自噬及感染结局的影响,揭示沙门菌毒力基因的致病机制,为治疗和控制肠道感染性疾病提供新思路。方法:一.沙门菌毒力基因spv B抑制细胞自噬的分子机制本课题第一部分选用鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium,S.typhimurium,STM)野生株STM-WT(携带沙门菌毒力基因spv B)、突变株STM-Δspv B(消除spv B基因)和回补株STM-c-Δspv B(利用重组载体将spv B导入Δspv B)分别感染He La细胞,建立体外细胞感染模型,进行下面实验:1.透射电子显微镜观察细胞的超微结构收集感染后1 h和2 h的细胞,制作超薄切片,用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察三株菌感染He La后细胞的超微结构,比较感染不同时间点细胞内自噬体的形成及细菌的侵袭情况。2.共聚焦激光显微镜观察LC3点状聚集用m RFP-GFP-LC3质粒转染He La细胞,细菌与细胞共作用1 h后,在共聚焦激光显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)下观察细菌感染后细胞内LC3的点状聚集;利用自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)和自噬抑制剂巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1,Baf)预处理,比较不同感染组之间黄色LC3的点状凝集颗粒的数目,以及药物干预前后LC3点状凝集颗粒的变化。3.共聚焦激光显微镜观察细胞骨架、蛋白与细菌的共定位将细胞铺入含小圆玻片的24孔板中,于细胞培养箱中培养至对数生长期,分别转染EGFP-Beclin-1、EGFP-Atg14和p GFP-ZFYVE 1质粒,与细菌共作用1 h后,用鬼笔环肽(phalloidin)染色细胞骨架,呈现红色,利用沙门菌特异性抗体与荧光二抗结合后对细菌进行着色,将细菌标记为蓝色,借助共聚焦激光显微镜观察细胞骨架、蛋白与细菌三者的共定位。4.荧光显微镜下观察p62与感染细菌共定位收集感染后1 h的细胞,抗体孵育后,荧光显微镜下观察各感染组中细菌与p62蛋白共定位情况,计算共定位的细菌占侵入细胞内细菌总数的百分比。5.Western blot法检测自噬相关蛋白和p70S6K磷酸化的水平收集感染后1 h和2 h的细胞,采用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)法检测自噬相关蛋白LC3,p62和Beclin-1的表达水平;在RAPA和Baf药物干预后,观察不同感染组之间自噬相关蛋白表达水平的变化。收集感染后1 h和3 h的细胞,Western blot法检测m TOR信号通路下游p70S6K蛋白表达水平,分析各不同感染组之间磷酸化表达水平的变化。6.平板计数法计算胞内活菌数收集感染感染后30 min、1 h、3 h和5 h的He La细胞,计算细胞胞内菌落形成单位(colony-forming unit,CFU)。平板菌落计数法分别记录不同感染组中胞内菌的个数。二.沙门菌毒力基因spvB对斑马鱼感染模型自噬和肠道病变的影响由于回补株STM-c-Δspv B需用L-阿拉伯糖诱导才能表达,不适合用于体内实验,所以本课题第二部分只选用鼠伤寒沙门菌STM-WT和STM-Δspv B作为体内实验菌株。1.构建斑马鱼肠道感染模型选取受精后5 dpf(days post-fertilization,dpf)的斑马鱼幼鱼,用Holtfreter buffer将菌液稀释至1×109 cfu/ml、1×108 cfu/ml、1×107 cfu/ml、1×106 cfu/ml、1×105 cfu/ml、1×104 cfu/ml,采用浸染法感染6 hpi(hours post infection,hpi)后,将斑马鱼放入Holtfreter buffer中,统计感染后7 d斑马鱼的死亡数目,绘制存活率曲线,计算半数致死量(median lethal dose,LD50)以确定感染最适浓度及不同菌株对斑马鱼生存的影响。2.平板菌落计数法分析细菌在斑马鱼体内的侵袭及播散能力收集6 hpi、24 hpi、72 hpi和120 hpi幼年斑马鱼,利用平板菌落计数法计算斑马鱼全鱼体内细菌量,同时进行阿米卡星(Amikacin,AMK)杀菌实验,计数杀死胞外菌后,入侵到斑马鱼胞内的活菌数,检测细菌的播散能力及体内繁殖情况。3.检测斑马鱼体内自噬水平收集感染不同时间点的斑马鱼,检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1和P62的表达,比较鼠伤寒沙门菌STM-WT和STM-Δspv B随感染时间的延长,斑马鱼体内自噬水平的变化;用透射电子显微镜观察两株菌在72 hpi斑马鱼肠道超微结构的变化及体内自噬体结构的形成。4.斑马鱼感染后肠道的病理学改变及凋亡水平测定用鼠伤寒沙门菌STM-WT和STM-Δspv B分别感染5 dpf斑马鱼,比较两株菌感染不同时间点对斑马鱼肠道的影响,普通光学显微镜观察斑马鱼肠腔的变化;病理切片HE染色观察肠道粘膜的病理学改变;用Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,同时采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测斑马鱼体内凋亡调控基因bcl-2的m RNA转录水平。5.检测沙门菌感染斑马鱼后体内炎症反应及巨噬细胞的吞噬功能分别取6 hpi、24 hpi、72 hpi和120 hpi的斑马鱼观察细菌感染对斑马鱼炎症反应的影响。q RT-PCR检测TNFα,IL-1β,IL-22和IL-10的m RNA水平。中性红染色法检测斑马鱼体内在不同感染组中随感染时间的延长巨噬细胞吞噬功能的变化。结果:一.沙门菌毒力基因spv B抑制细胞自噬的分子机制1.spv B抑制自噬体形成:用TEM观察STM感染后He La细胞的超微结构,结果显示突变株STM-Δspv B感染后1 h出现典型双层膜自噬体结构,随着感染时间的延长,在感染后2 h出现单层膜的自噬溶酶体结构,其内包裹着细胞器和一些待降解的物质成分,而在野生株STM-WT和回补株STM-c-Δspv B感染组中未见到自噬体形成,但可观察到含沙门菌囊泡(Salmonella-containing vacuoles,SCV)和胞内菌明显增多,且随感染时间的延长,细菌数量显著增加。2.spv B抑制自噬体形成的早期阶段:用m RFP-GFP-LC3转染He La细胞,通过CLSM观察LC3点状凝集,结果发现突变株STM-Δspv B感染组中黄色LC3点状聚集明显多于携带spv B基因的STM感染组,且突变株感染组中蓝色细菌周围存在黄色LC3点状聚集。经RAPA和Baf药物干预后,结果显示,突变株STM-Δspv B感染组中黄色LC3点状聚集仍然多于其他两组携带spv B基因的感染组,且蓝色细菌周围存在黄色LC3的聚集。3.spv B影响自噬相关蛋白表达:Western blot检测自噬相关蛋白LC3,p62及Beclin-1的表达水平,结果发现突变株STM-Δspv B感染组中胞浆型LC3(即LC3-I)向膜型(即LC3-II)的转化量显著高于野生株STM-WT和回补株STM-c-Δspv B感染组,Beclin-1的表达水平明显高于其他感染组,而自噬底物蛋白p62表达水平显著低于其他感染组。RAPA处理后,STM-Δspv B感染组中LC3的转化量和Beclin-1均有所增加,p62则较其他各组有明显下降。Baf干预后,各感染组中LC3的转化量显著增加,p62表达量也较其他各干预组有显著增加,STM-Δspv B感染组中LC3的转化量、Beclin-1和p62表达水平均高于STM-WT和STM-c-Δspv B。4.spv B抑制p62与胞内菌的共定位:利用免疫荧光法检测p62与感染细菌共定位,在荧光显微镜下观察,突变株STM-Δspv B感染组中p62点状聚集较其他感染组显著增多,且p62与细胞内感染细菌的共定位明显增加,而在STM-WT和STM-c-Δspv B感染组中仅发现有少量的p62与细胞内感染细菌共定位。5.通过CLSM观察细菌与细胞骨架及蛋白的共定位:结果显示STM-WT和STM-c-Δspv B感染后1 h可诱导He La细胞中F-Actin肌动蛋白丝解聚,同时Beclin-1、Atg14和ZFYVE 1蛋白表达量显著降低,在突变株STM-Δspv B感染组中,细胞肌动蛋白丝结构明显,且细菌分别与Beclin-1、Atg14和ZFYVE 1蛋白发生共定位。6.spvB通过mTOR信号通路抑制宿主细胞自噬:Western blot检测磷酸化p70S6K蛋白,结果显示突变株STM-Δspv B感染后1 h,p70S6K磷酸化水平较其他感染组明显降低,这种现象在感染后3 h仍然存在。7.spv B可促进细菌在胞内的繁殖:胞内CFU计数,结果显示在感染后1 h胞内CFU即出现差异,感染后3 h出现STM-Δspv B感染组胞内CFU显著低于STM-WT和STM-c-Δspv B感染组,这种差异在感染后5 h更加显著。二.沙门菌毒力基因spv B对斑马鱼感染模型自噬和肠道病变的影响1.建立斑马鱼肠道感染模型:STM感染5 dpf的斑马鱼建立体内感染模型,通过记录7 d内感染不同剂量间斑马鱼的死亡和存活率,确定1×108 cfu/ml为感染最适菌量,并绘制生存曲线及计算半数致死量LD50,结果显示斑马鱼死亡数量随感染浓度的递减而减少,随感染时间的延长而增加。用Reed-Muench法计算STM-WT和STM-Δspv B对斑马鱼的致病性,结果发现STM-WT的LD50为1.33×106cfu/ml,STM-Δspv B的LD50为2.22×106cfu/ml,说明spv B可显著降低沙门菌对斑马鱼的LD50。2.观察STM在斑马鱼体内的播散及繁殖情况:采用平板菌落计数法记录STM感染后斑马鱼体内细菌的侵袭、播散及繁殖能力,结果显示斑马鱼体内感染细菌菌量随感染时间的延长而成指数增加;加入阿米卡星(Amikacin,AMK)作用后,发现各组细菌菌量均有所减少,在72 hpi斑马鱼体内感染鼠伤寒沙门菌STM-WT的菌量显著高于感染STM-Δspv B,这种差异在120 hpi更加明显,说明spv B具有促进细菌入侵,增强细菌繁殖的能力。3.检测沙门菌感染对斑马鱼体内自噬的影响:收集6 hpi、24 hpi、72 hpi和120 hpi的斑马鱼,检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1和P62的表达,结果显示突变株STM-Δspv B在72 hpi LC3的转化量显著高于携带spv B的STM感染组,Beclin-1的表达水平明显高于其他感染组,而自噬底物蛋白p62表达水平显著低于其他感染组。用TEM观察沙门菌感染72 hpi斑马鱼肠道超微结构,结果显示突变株STM-Δspv B感染组中斑马鱼肠道组织内出现明显的双层膜自噬体结构。野生株STM-WT感染组中可看到大量的沙门菌入侵斑马鱼肠道上皮粘膜层,且肠道微绒毛排列紊乱,甚至出现脱落现象且肠道柱状上皮细胞结构不清晰。4.观察沙门菌感染后斑马鱼肠道的形态学改变及凋亡水平测定:通过普通光学显微镜观察发现,野生株STM-WT感染组中,斑马鱼肠道随感染时间的延长肠腔变窄,肠道内容物模糊不清,肠腔内面积减少,而突变株STM-Δspv B感染组中,斑马鱼肠道病变明显较野生株轻。病理切片后HE染色观察发现,随感染时间的延长斑马鱼肠道上皮微绒毛排列紊乱,在120 hpi肠腔内出现大量炎性细胞浸润,突变株STM-Δspv B感染组中斑马鱼肠道病变较野生株轻,但也观察到不同程度的肠腔狭窄和炎性细胞浸润。Western blot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,结果发现120 hpi STM-WT感染组中Bcl-2表达显著低于STM-Δspv B感染组,同时采用q RT-PCR检测bcl-2的m RNA转录水平发现在120 hpi野生株STM-WT感染组中bcl2表达显著低于突变株STM-Δspv B感染组。5.沙门菌感染后斑马鱼体内炎症反应及吞噬细胞的吞噬功能:利用实时荧光定量PCR分析TNFα,IL-1β,IL-22和IL-10在斑马鱼体内的转录水平,结果显示STM-WT感染组中以上基因m RNA转录水平随感染时间的延长而逐渐升高,在感染后6 h STM-WT和STM-Δspv B感染组中斑马鱼体内炎症的标志性基因表达水平并无显著性差异,感染后120 h STM-Δspv B感染组中炎症的标志性基因的表达显著低于STM-WT感染组。沙门菌感染诱导斑马鱼体内固有免疫应答,中性红染色法检测斑马鱼感染后巨噬细胞吞噬能力,分别收集6 hpi、24 hpi、72 hpi和120 hpi四个时间点感染鼠伤寒沙门菌STM-WT和STM-Δspv B的斑马鱼,采用中性红染色液对斑马鱼体内巨噬细胞进行染色,结果发现随着感染时间的延长,各感染组中斑马鱼体内巨噬细胞吞噬功能均不断升高,两组细菌感染后巨噬细胞吞噬功能未见明显差异。结论:1.spvB基因通过解聚细胞骨架从而抑制细胞自噬体形成。2.spvB基因产物通过激活mTOR信号通路从而抑制宿主细胞自噬体形成。3.spv B基因可增强细菌毒力,加强对斑马鱼肠道的致病性,影响斑马鱼体内自噬水平,诱导斑马鱼体内炎症反应,对巨噬细胞吞噬功能未见显著影响。
