近年来,抗生素原料药的生产在我国得到了长足的发展,但是在生产上仍然存在着技术水平较低、生产成本较高等普遍问题。特别是在以红霉素为代表的抗生素大宗发酵产品上,产品发酵单位与国际先进水平相比差距较大；发酵产品成分复杂,有效组分含量偏低。本论文以红霉素工业生产菌红色糖多孢菌为研究对象,以提高红霉素的产量和组份纯度为出发点,以实验室前期红霉素生产菌分子育种存在的难点为突破口,通过代谢工程的方法,从多个层次对红霉素生产菌株进行代谢工程改造。期望以红霉素生产菌的分子育种为样本,找到一条改造微生物发酵天然产物的通用之路,从而为我国大宗发酵产品生产技术提升作出一些努力。论文首先从技术层面上解决在红霉素工业生产菌株红色糖多孢菌Saccharopolyspora erythraea HL3163 E3中高效稳定导入外源基因的问题。我们通过同源双交换重组把ΦC31整合酶所识别的特异序列attB导入到红色糖多孢菌E3染色体上一段没有功能NRPS合成酶基因的中部,从而在红色糖多孢菌中人为地构建了一个基于ΦC31整合酶介导的位点特异性重组插入盒,使外源基因能快速、高效、稳定地整合到红色糖多孢菌的染色体中。在奠定论文工作的技术基础后,我们利用此插入盒采用不同的基因构建方式强化红霉素D转化为红霉素A的两个限速酶——羟基化酶EryK和甲基化酶EryG的表达,使红霉素杂质组份B和C明显降低。当我们在红色糖多孢菌内组成型共表达四个基因：甲基化酶EryG、羟基化酶EryK、S-腺苷甲硫氨酸合成酶SAM-s及透明颤菌蛋白血红蛋白Vhb,中间产物红霉素B和C的积累几乎为零,同时红霉素A的产量也提高了约30%。在解决红霉素杂质组份积累的同时,我们发现红霉素聚酮合成酶(PKS)可能是限制红霉素产量的一个关键瓶颈,其基因长达32 kb。为了强化表达PKS,我们构建了红色糖多孢菌工业生产菌株S.erythraea HL3168 E3基因组cosmid文库,并筛选出一个包含有完整PKS的黏粒C5,把黏粒C5通过ΦC31整合酶介导的盒式插入整合到红色糖多孢菌S.erythraea HL3168 E3染色体中,获得了红霉素聚酮合成酶基因拷贝数倍增的重组菌S. erythraea E3-C5。我们发现重组菌的红霉素产量得到了显著提高：摇瓶发酵中产量比出发菌株提高了40%；50 L发酵罐的中试结果表明,与出发菌株HL3168 E3相比,重组菌株E3-C5不仅产量提高了近50%,发酵周期也缩短了三分一此外,我们还初步尝试了通过操纵初级代谢以及调控因子来影响次级代谢产物的合成。但是无论是强化表达了与红霉素合成前体直接相关连的几个酶：甲基丙二酰辅酶A变位酶、甲基丙二酰辅酶A异构酶、丙酰辅酶A羧化酶和丙酸激酶,还是强化表达可能与红霉素合成相关的调控因子RelA和BldD蛋白,红霉素的产量均未产生明显改变。在本论文的最后,我们还尝试了在大肠杆菌中异源合成红霉素的部分工作。通过探索在大不同肠杆菌宿主中异源合成红霉素的大环骨架—6-脱氧红霉内酯(6-DEB),我们发现大肠杆菌B系列菌株要比K-12系列菌株更适合生产6-脱氧红霉内酯。同时,在大肠杆菌中补充稀有密码子能够提高异源表达聚酮类化合物的产量。这些工作为在大肠杆菌中选择合适的宿主,实现红霉素异源合成的工业化生产提供了参考。
