响应面法优化重组枯草芽孢杆菌发酵生产青霉素G酰化酶

青霉素G酰化酶(Penicillin G Acylase, PGA)是β-内酰胺类抗生素工业生产中的关键生物催化剂,对半合成抗生素工业有着十分重要的意义。枯草芽孢杆菌(B.subtilis)表达系统是一类高效的微生物表达系统,其相对于大肠杆菌(E.coli)表达系统而言有较大的优势,枯草芽孢杆菌有较强的分泌系统,能将目的蛋白分泌到胞外,便于后续目的蛋白的分离纯化。本实验利用响应面法对本实验室所构建的表达青霉素G酰化酶的重组枯草芽孢杆菌发酵条件进行了优化。通过Plackett-Burman实验方法研究了碳源、氮源、无机盐、温度、发酵时间、摇床转速等19个因素对菌株产青霉素G酰化酶的影响。实验结果表明,发酵温度和酵母提取物是影响产酶的显著因素。随后利用中心组合设计实验对这两种显著影响因素进行了优化,应用响应面模型进行预测,并且利用摇瓶发酵实验进行验证,结果表明,在摇瓶条件下,当发酵温度为34℃,酵母提取物为8.8g/L时,最终的酶活达到28.2U/mL,优化预测值与实际实验值拟合度达到了99%,比初始发酵培养基条件下的酶活提高了1.19倍。之后在摇瓶优化的基础上,按照最佳优化培养条件对该菌株进行15L的发酵罐扩大培养,并研究了流加补料对产酶的影响,最终确定为在对数增长中期进行流加补充培养基与水的发酵工艺,发酵40小时发酵液中青霉素G酰化酶的酶活最高可以达到60U/mL。