L1CAM在胰腺癌进展中作用机制及IGFBP7在胰腺癌中表达与临床意义

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胰腺癌(Pancreatic cancer, PanCa)是一种恶性程度极高的消化道肿瘤,由于其疾病进展迅速,早期就发生转移,特别是腹膜后复发和肝转移,使得胰腺癌患者的预后极差,5年生存率<6%。研究发现,许多细胞因子及生长因子通过多种信号通路途径调节粘附分子、血管生成因子、蛋白水解酶等表达,从而促进胰腺癌侵袭转移的发生。外周神经侵袭也是胰腺癌侵袭转移的一种特殊方式,是其早期发生远处转移、产生顽固性腹痛和“根治性”术后较高复发率的主要原因之一。然而,目前无论是胰腺癌神经侵袭还是经典的转移方式其分子机制都不是十分清楚。进一步研究胰腺癌侵袭转移的分子机制不仅有助于判断胰腺癌的转移和预后,同时也为有效抑制胰腺癌侵袭转移提供了潜在的分子靶点。细胞粘附分子L1(cell adhesion molecular L1, L1CAM)是免疫球蛋白超家族成员之一,在多种实性肿瘤中的研究表明:L1CAM具有促进细胞增殖及瘤体生长、抑制细胞凋亡、增加肿瘤细胞的迁移及侵袭能力、介导癌细胞耐药株产生的作用。在人胰腺癌的组织中,L1CAM高表达于低分化癌、肿瘤侵袭的前端、受累淋巴结及肝转移病灶内。近年来,研究还发现L1CAM也过表达在胰腺癌侵犯的神经内,与胰腺癌神经侵犯呈正相关。因此,推测L1CAM可能参与了胰腺癌疾病进展,然而其相关的分子机制并不清楚。此外,胰腺癌至今为止没有发现可靠的预后标记物及分子治疗靶点。因此,进一步了解胰腺癌进展的分子机制并寻找潜在的预后标记物,对提高胰腺癌的治疗水平具有重要意义。胰岛素样生长因子结合蛋白7(Insulin-like growth factorbinding protein7,IGFBP7),是胰岛素—胰岛素样生长因子代谢轴的一员,有着调节细胞增殖分化、促进细胞凋亡和衰老的功能。IGFBP7表达下调与多种肿瘤不良预后有关如:大肠癌、乳腺癌及肝癌等,然而IGFBP7与胰腺癌的关系如何目前尚无研究报道。一、慢病毒干扰载体的构建及验证目的:以L1CAM为靶基因建立慢病毒介导的shRNA干扰载体并验证其有效性。方法:采用RT-PCR挑选出L1CAM表达较高的胰腺癌细胞株;利用已知有效的siRNA序列,合成慢病毒介导的shRNA干扰载体,并转染该胰腺癌细胞株,通过荧光表达率确定所用病毒量;最后按比例扩大体系,用Western Blot的方法验证干扰效果,及确定干扰时间。结果:七株胰腺癌细胞(Capan-2, Panc-1,AsPC-1, BxPC-3, sw1990, Patu-8988和CFPAC-1)均有L1CAM的表达,其中Capan-2细胞中表达最高,约是最低者(BxPC-3)的36.7倍(P<0.001)。慢病毒(1×108TU/ml)用量为20ul/5×103个细胞,此时转染率>85%。干扰组(L1CAM-siRNA)与阴性对照组(L1CAM-NC)96小时的转染率分别为87.41±6.06、85.32±3.59,两者之间无差别(P=0.635);但L1CAM-siRNA组L1CAM的表达远远低于L1CAM-NC组(P<0.001)。结论:成功地构建了针对L1CAM的慢病毒干扰载体,该载体可敲除L1CAM的表达,为后续实验的进行奠定了基础。二、胰腺癌PNI体外模型的建立及L1CAM在其中的作用目的:构建胰腺癌PNI的体外实验模型,并观察L1CAM对胰腺癌PNI的作用。方法:将大鼠背根神经节(DRG)与胰腺癌Capan-2细胞在Matrigel基质胶中共培养建立PNI体外模型。在此基础之上,分别建立DRG与L1CAM-siRNA组细胞及L1CAM-NC组细胞的共培养模型,利用专业图像分析软件Image proplus对图片进行分析以观察干扰L1CAM表达后是否对DRG与细胞的生长产生影响。结果:胰腺癌PNI体外模型中,Capan-2细胞向DRG方向爬行迁移,包裹神经突并沿之生长。在胰腺癌PNI体外模型中,干扰L1CAM后细胞形成的集落面积(Day5:230.31±14.89um2)显著低于阴性对照组(Day5:308.24±18.37um2,P=0.005);并且几乎没有向DRG方向发生迁移。而干扰细胞表达L1CAM对DRG的生长不产生明显的影响。结论:本实验建立了胰腺癌Capan-2细胞与DRG体外共培养模型,并观察到Capan-2细胞的嗜神经性及侵袭神经突的过程。应用该模型,在体外证实了L1CAM通过促进细胞集落形成及迁移爬行的方式参与了胰腺癌Capan-2细胞的神经侵袭作用。三、L1CAM对胰腺癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响及相关机制的研究目的:探讨干扰L1CAM表达后对胰腺癌Capan-2细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响及相关的机制。方法:采用CCK-8试剂盒检测干扰L1CAM表达前后胰腺癌Capan-2细胞的增殖活性,并用流式细胞仪分析细胞周期的分布。接着利用Tunel法检测干扰L1CAM表达前后细胞发生凋亡的情况,并用流式细胞仪分析早、晚期凋亡的差别。采用侵袭小室验证干扰L1CAM后对Capan-2细胞侵袭性的影响。最后采用Western Blot的方法检测Ras/Raf/Mek/Erk信号通路的活化情况。结果:敲除L1CAM使Capan-2细胞增殖活性降低,G0/G1期的细胞滞留比例增高(P=0.025);细胞侵袭性也受到抑制(穿过滤膜的细胞数为:299±23vs.88±14个/高倍镜视野,P<0.001)。但敲除L1CAM表达对细胞凋亡无明显影响。最后我们还发现干扰L1CAM表达后活化的Erk蛋白明显减少(P=0.002)。结论:本部分研究证实了L1CAM通过活化Ras/Raf/Mek/Erk信号通路,促进细胞增殖,增强侵袭性,从而参与了胰腺癌侵袭转移并在其疾病进展过程中扮演一定角色。四、IGFBP7在胰腺癌组织中的表达及预后的研究目的:评估IGFBP7在胰腺癌组织中的表达,并分析其表达与临床病理特征及胰腺癌预后的关系方法:采用半定量免疫组化的方法检测190例胰腺导管腺癌患者组织中IGFBP7的表达,并采用卡方检验分析其与p53表达、ki-67表达及临床病理特征的关系,最后采用Kaplan-meier及Cox多因素分析IGFBP7的表达与胰腺癌预后的关系。结果:相比癌旁正常组织,IGBFP7在胰腺癌组织中的表达明显下调(p<0.001),并与ki-67的表达呈负相关(r=-0.284, p<0.001)。IGFBP7的表达与临床病理特征之间无显著相关如:肿瘤大小、淋巴结受累状态、临床分期等。我们还发现IGFBP7表达的下调是一个胰腺癌预后不佳的独立危险因素(HR,1.38;95%CI,1.00-1.91; P=0.05)。结论: IGFBP7在人胰腺癌组织中表达下调,并且其表达的下调与增殖指数及不良预后有关。在胰腺癌中,IGFBP7可能扮演了肿瘤抑制因子的作用。
中文摘要第5-8页
英文摘要第8-11页
英文缩略词表第12-13页
前言第13-16页
第一部分 慢病毒干扰载体的构建及验证第16-34页
    实验材料第16-22页
    实验方法第22-27页
    实验结果第27-31页
    讨论第31-34页
第二部分 胰腺癌神经侵袭体外模型的建立及L1CAM在其中的作用第34-48页
    实验材料第35-36页
    实验方法第36-39页
    实验结果第39-44页
    讨论第44-48页
第三部分 L1CAM对胰腺癌细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响及可能的机制第48-64页
    实验材料第48-51页
    实验方法第51-56页
    实验结果第56-60页
    讨论第60-64页
第四部分 IGFBP7在胰腺癌中的表达及预后研究第64-75页
    实验材料第64-65页
    实验方法第65-67页
    实验结果第67-73页
    讨论第73-75页
全文总结第75-76页
文献综述第76-91页
参考文献第91-100页
在读期间发表论文第100-101页
致谢第101页
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