[目的]神经母细胞瘤由于异质性的存在,导致治疗极其困难,尤其高危神经母细胞瘤。目前多模式高强度治疗,包括自体干细胞支持下的清髓性化疗,由于毒性非常明显,几乎没有空间去增加现有的治疗强度。免疫治疗模式或许是最好的选择,尤其是在控制MRD (Minimal Residual Disease)和防止复发的维持治疗中具有喜人前景。近年来基于WT1蛋白肽疫苗的免疫治疗成功应用于血液病和成人的多种实体瘤的治疗中,主要包括传统治疗抵抗病人的进展控制和消灭MRD的维持治疗,在儿童的实体瘤治疗中也有成功病例报道。由此我们试想基于WT1蛋白肽疫苗的免疫治疗能否应用于儿童神经母细胞瘤的治疗,尤其是骨髓的MRD控制。要回答这问题,我们必须了解WT1基因在神经母细胞瘤中的功能。本次研究目的试图阐明WTl在神经母细胞瘤中的具体生物学功能以及WT1在肿瘤组织中的表达情况,为WT1蛋白肽疫苗能否用于神经母细胞瘤的治疗提供依据和/或为新的生物治疗模式提供靶点。[方法]应用普通PCR和实时定量PCR技术获得WT1mRNA在NBs (Neuroblastomas)和GNs (Ganglioneuromas)中表达情况,评估WT1mRNA的表达量与神经母细胞瘤的临床分期、组织分化程度及临床预后的关系；使用普通PCR和实时定量PCR技术评估WT1mRNA在4种NB细胞系(NB1、NB19、NB69和SK-N-SH)中的表达情况,同时为后面实验中细胞系的选择提供依据；利用普通PCR和实时定量PCR方法评估siRNA技术敲除NB19和NB69中WT1效率；采用siRNA干扰技术敲除NB19和NB69两种神经母细胞系的WT1,利用WST-1进行细胞增殖测定,评估WT1沉默后对细胞增殖的影响。从而推断WT1在神经母细胞瘤发生中的可能作用。应用免疫组织化学染色观察WT1蛋白在NBs和GNs中的表达情况,评估WT1蛋白表达与组织分化程度的关系；采用siRNA干扰技术敲除NB19和NB69两种神经母细胞系的WT1,观察WT1沉默后对RA (RetinoicAcid, RA)诱导神经母细胞分化效应的影响。了解WT1在神经母细胞分化过程的作用。统计学方法：NBs和GNs中WT1mRNA表达量比较采用Mann-Whitney Test;采用Kruskal-Wallis Test评估WT1 mRNA表达量与临床分期的关系：使用Kaplan-Meier生存曲线和Log-Rank Test观察WT1 mRNA表达量与临床预后的关系。NB19或NB69细胞系中Control siRNA组和Test siRNA (WT1)组细胞数的比较采用的是t-test。采用Fisher’s Exact Probability Test评估WT1蛋白在NBs和GNs中阳性率的差异。采用SPSS13.0统计软件进行数据处理分析。[结果]1.在NBs和GNs中WT1mRNA表达水平与神经母细胞瘤的临床分期、组织分化程度及临床预后的关系：在代表病变广泛的高临床分期组中,WT1mRNA并未出现高水平表达(P=0.412)；与成熟的节细胞神经瘤相比,同样在代表恶性度高的原始神经母细胞瘤组中也未出现有意义的差别表达(p=0.261)；生存分析显示高水平WT1 mRNA表达并不影响预后(p=0.193)。2.WT1mRNA在NB细胞系中的表达情况：WT1mRNA在4种神经母细胞系(NB1、NB19、NB69和SK-N-SH)中都存在阳性表达,并且最高水平表达出现在缺乏MYCN扩增即恶性度较低的NB69中。3. siRNA技术敲除NB19和NB69中WT1效率结果：与control siRNA相比,WT1siRNA组中的条带明显变窄,说明WT1基因表达被明显抑制；实时定量RT-PCR提示WT1基因敲除效率在NB19和NB69中分别为74.3%±13.3%和72.3%±10.5%,显示出很好的敲除效率。4.利用siRNA技术和WST-1观察WT1基因沉默对后NB19和NB69细胞增殖的影响,结果显示：与相应control siRNA组相比,虽然NB19细胞系中WT1siRNA组没有明显变化(p=0.937),但在NB69 (WT1mRNA表达水平最高)细胞系中,WT1 siRNA组呈现细胞增殖明显增加(p=0.193),说明WT1在神经母细胞的生长扩增方面发挥负向调控功能。5.WT1蛋白表达与组织分化程度的关系结果显示：从阳性的比例看,NBs中多克隆抗体和单克隆抗体的阳性率分别为10%和30%,而GNs的阳性率均为100%,二者之间比较差异具有统计学意义(p=0.000和p=0.009)；从染色强度看,原始神经母细胞呈不表达或低表达,而成熟节细胞呈现明显强表达。6.利用siRNA干扰技术观察WT1基因敲除后是对All-trans-RA诱导分化效应的影响,结果显示：与RA和RA+Control siRNA组相比,RA+Test siRNA组中细胞的神经突出延伸明显缩短,在NB19细胞系中表现更为明显,显示WT1参与了神经母细胞的分化过程。[结论]1.在代表病变广泛的高临床分期组中和代表恶性度高的原始神经母细胞瘤组中WT1mRNA并未出现高水平表达；生存分析显示高水平WT1 mRNA表达并不影响预后；高水平WT1mRNA表达出现在缺乏MYCN扩增即恶性度较低的NB69细胞系中；WT1基因沉默后,神经母细胞增殖出现上升。这些提示WT1在神经母细胞瘤的发生中并未发挥促进作用,而是发挥负向调控功能,可能是一个抑癌基因。2.神经母细胞肿瘤中,分化程度高的组织或细胞呈现更高水平的WT1表达；WT1基因敲除后,All-trans-RA诱导分化效应受到抑制,显示WT1参与了神经母细胞的分化过程。结合前面实验结果：WT1基因具有抑制神经母细胞生长的功能。提示WT1可能一个内源性诱导分化和/或退化的因子,具有启动原始神经母细胞向成熟的节细胞分化或退化的潜能。3.WT1蛋白在原始神经母细胞瘤中表达阳性率低,染色强度弱,并且细胞学实验显示WT1呈现抑癌特性并具有神经母细胞向成熟的节细胞分化或退化的潜能,说明基于WT1蛋白肽疫苗的免疫治疗不适合神经母细胞瘤的治疗,但它可以成为新的生物治疗模式的靶点
