第一部分RANKL介导Ghrelin抑制血管平滑肌细胞成骨样分化的机制研究第一章Ghrelin下调RANKL在小鼠血管平滑肌细胞的表达目的：观察核因子-KB受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand, RANKL)在小鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)成骨样分化过程中的表达,以及Ghrelin对RANKL表达的影响。方法：分离小鼠的原代VSMCs,细胞免疫化学法及Western blot法检测平滑肌肌动蛋白α (smooth muscle a-actin,SMa-actin),鉴定其细胞表型；使用10mMβ-甘油磷酸钠(β-glycerophosphate, p-GP)诱导小鼠原代VSMCs向成骨样细胞分化,以10-6～10-8M的Ghrelin干预β-GP诱导的小鼠VSMCs, Western blot分析法检测Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor2, Runx2)蛋白的表达；荧光定量PCR (polymerase chain reaction)检测RANKL、Runx2、骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2) mRNA的表达；酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测RANKL蛋白的分泌量；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)试剂盒检测ALP活性；茜素红染色观察矿化结节的形成情况。结果：(1)成功分离了小鼠原代VSMCs,细胞免疫化学法及Western blot结果显示SMa-actin表达阳性；(2)p-GP可显著增加Runx2和BMP-2的表达,增强ALP活性,促进矿化结节形成；在β-GP诱导的小鼠VSMCs向成骨样细胞分化的过程中RANKL mRNA和蛋白的表达量均显著增加；(3)10-6～10-8M的Ghrelin呈时间和剂量依赖性抑制ALP活性和RANKL表达。结论：成功分离了小鼠原代VSMCs,并构建VSMCs向成骨样细胞分化的体外细胞模型；Ghrelin抑制VSMCs向成骨样细胞分化,并下调RANKL的表达。第二章RANKL介导Ghrelin抑制小鼠血管平滑肌细胞的成骨样分化目的：探讨RANKL在Ghrelin抑制小鼠VSMCs成骨样分化中的作用。方法：构建RANKL过表达质粒,以RANKL过表达质粒转染小鼠VSMCs,使用Ghrelin干预过表达RANKL的小鼠VSMCs。荧光定量PCR检测RANKL、Runx2mRNA的表达,ALP试剂盒检测ALP活性。结果：(1)RANKL过表达质粒可显著增加RANKL的表达；(2) RANKL过表达后,Ghrelin抑制ALP活性和Runx2表达的作用消失,说明RANKL阻断了Ghrelin抑制VSMCs向成骨样细胞分化的作用。结论：RANKL介导了Ghrelin抑制VSMCs的成骨样分化。第三章Ghrelin抑制小鼠血管平滑肌细胞成骨样分化的机制研究目的：研究Ghrelin抑制小鼠VSMCs向成骨样细胞分化的作用机制。方法：以106M的Ghrelin干预小鼠VSMCs,提取细胞总蛋白和磷酸化蛋白,行Western blot并观察5-60min不同时间点促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶/Akt (PI3K/Akt)磷酸化蛋白的表达；结合ERK通路阻断剂PD98059和PI3K阻断剂LY294002,检测ERK和Akt信号通路阻断后,RANKL、Runx2表达和ALP活性的变化,进一步探讨Ghrelin抑制小鼠VSMCs向成骨样细胞分化的作用机制。结果：(1)Ghrelin激活p-ERK和p-Akt的表达,但对P38和JNK磷酸化没有激活作用；(2) ERK阻断剂PD98059和PI3K阻断剂LY294002均可阻断Ghrelin抑制RANKL与Runx2的表达和ALP的活性。结论：Ghrelin通过ERK/RANKL和Akt/RANKL信号通路抑制小鼠VSMCs向成骨样细胞分化。第二部分Ghrelin抑制成骨细胞MC3T3-E1凋亡的作用机制研究第一章Ghrelin抑制无血清饥饿诱导的小鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡目的：研究10-9～10-11M的Ghrelin对无血清饥饿诱导小鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡的影响。方法：以10-9～10-11M Ghrelin干预小鼠成骨细胞MC3T3-E1,分别以TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling)法和ELISA法检测MC3T3-E1细胞凋亡情况。Western blot法检测Bcl-2、Bax蛋白表达以及caspase-3的分泌。结果：(1)10-9～10-11M的Ghrelin呈剂量依赖性抑制无血清饥饿诱导的MC3T3-E1细胞凋亡；(2)10-9～10-11M的Ghrelin呈剂量依赖性促进Bcl-2蛋白表达,抑制Bax蛋白表达以及caspase-3分泌。结论：Ghrelin抑制无血清饥饿诱导的小鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡。第二章Ghrelin通过GHSR/ERK和GHSR/Akt信号通路抑制MC3T3-E1细胞凋亡目的：探讨Ghrelin抑制小鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡的作用机制。方法：RT-PCR和Western blot法检测GHSR在小鼠成骨细胞MC3T3-E1的表达。使用RNA干扰技术阻断GHSR表达。10-9M的Ghrelin干预MC3T3-E1细胞,Western blot法检测不同时间点p-ERK、 ERK、p-JNK、JNK、p-p38、p38. p-Akt、Akt表达。联合ERK阻断剂PD98059和PI3K阻断剂LY294002,观察Ghrelin抑制MC3T3-E1细胞凋亡的细胞信号机制。结果：(1)GHSR在小鼠成骨细胞MC3T3-E1表达,并且GHSR表达被GHSR-siRNA阻断；(2)109M的Ghrelin激活p-ERK和p-Akt,但不激活p-JNK和p-p38; ERK阻断剂PD98059和PI3K阻断剂LY294002及GHSR-siRNA均可阻断Ghrelin激活ERK和Akt信号通路。(3) ERK和Akt信号通路被阻断或GHSR敲除后,Ghrelin抑制MC3T3-E1细胞凋亡的作用消失。结论：Ghrelin通过GHSR/ERK和GHSR/Akt信号通路抑制小鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡。
