迟钝爱德华氏菌耐药质粒pEIB202与waaL基因的功能鉴定及毒力相关分析
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迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种重要的革兰氏阴性病原菌。该病原菌能引起鱼类出血性败血症,给水产养殖业造成巨大损失。在本实验室前期工作中,从发病大菱鲆体内分离得到一株迟钝爱德华氏菌强毒株EIB202,并发现EIB202中含有一个43.7 kb的大质粒。本文对大质粒pEIB202进行序列分析,发现该质粒携带多个抗性基因,为耐药性质粒(R质粒)。此外,该质粒还编码部分四型分泌系统(T4SS)组分,暗示该质粒可能与E. tarda的多重耐药性及致病力相关。本论文以sacB作为反向筛选标记得到一株质粒消除的突变株EIB202Δp,该菌株除氯霉素及四环素抗性消失外,在生长、毒力、胞外蛋白分泌等方面均与野生株无显著差异,证明该质粒是造成EIB202多重耐药性的主要原因,而在其致病过程中可能并不起直接作用。革兰氏阴性细菌表面脂多糖(LPS)结构在保护细菌免受外界伤害及细菌致病力方面起重要作用。本文分析了EIB202中与脂多糖合成相关的基因簇,并考察了O-特异性侧链连接酶(WaaL)在E. tarda LPS合成及致病过程中的作用。利用无标记缺失突变技术,对EIB202Δp waaL基因进行了框内基因缺失。waaL基因缺失导致EIB202Δp脂多糖0-特异性侧链部分缺失,证实了WaaL蛋白在连接O-特异性侧链与核心寡糖过程中起主要作用。此外,AwaaL突变株在抵抗血清、高渗、过氧化物、多粘菌素B等环境压力较野生菌株有明显下降。对鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)侵染的能力下降,对模式动物的半致死剂量(LDso)上升。以上结果证明O-特异性侧链连接酶对迟钝爱德华氏菌的环境适应性及致病力有重要作用,为阐明迟钝爱德华氏菌致病机理及疫苗的开发提供了参考。
| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 文献综述 | 第10-23页 |
| 1.1 水产养殖及其病害 | 第10页 |
| 1.2 迟钝爱德华氏菌——一种重要的水产养殖致病菌 | 第10-14页 |
| 1.2.1 迟钝爱德华氏菌的分类学及流行病学 | 第10-11页 |
| 1.2.2 迟钝爱德华氏菌的生化特性及血清分型 | 第11-13页 |
| 1.2.3 迟钝爱德华氏菌致病机制的研究状况 | 第13-14页 |
| 1.3 水产养殖病害的抗生素防治与耐药性质粒(R质粒)的转移 | 第14-16页 |
| 1.3.1 R质粒及其抗药性机制 | 第14-15页 |
| 1.3.2 R质粒中抗性基因的扩散与进化 | 第15页 |
| 1.3.3 R质粒与毒力相关分析 | 第15-16页 |
| 1.4 脂多糖与病原菌的致病性 | 第16-22页 |
| 1.4.1 概述 | 第16-17页 |
| 1.4.2 LPS的结构组成 | 第17-18页 |
| 1.4.3 LPS的合成 | 第18-21页 |
| 1.4.4 LPS与细菌毒力相关分析 | 第21-22页 |
| 1.5 本课题的主要内容和意义 | 第22-23页 |
| 第2章 迟钝爱德华氏菌大质粒pEIB202序列及特性分析 | 第23-29页 |
| 2.1 引言 | 第23页 |
| 2.2 实验材料 | 第23-24页 |
| 2.2.1 菌株及培养基 | 第23页 |
| 2.2.2 主要仪器、试剂盒及材料 | 第23-24页 |
| 2.3 实验方法 | 第24-25页 |
| 2.3.1 质粒拷贝数测定 | 第24页 |
| 2.3.2 质粒接合效率测定 | 第24-25页 |
| 2.4 实验结果 | 第25-27页 |
| 2.4.1 质粒pEIB202全序列分析 | 第25-26页 |
| 2.4.2 质粒拷贝数测定 | 第26页 |
| 2.4.3 质粒接合效率测定 | 第26-27页 |
| 2.5 讨论 | 第27-28页 |
| 2.6 小结 | 第28-29页 |
| 第3章 迟钝爱德华氏菌大质粒pEIB202的消除及其对表型的影响 | 第29-39页 |
| 3.1 引言 | 第29页 |
| 3.2 实验材料 | 第29-31页 |
| 3.2.1 菌株、引物及培养基 | 第29-31页 |
| 3.2.2 主要试剂、试剂盒及材料 | 第31页 |
| 3.3 实验方法 | 第31-35页 |
| 3.3.1 sacB标记质粒的构建 | 第33页 |
| 3.3.2 pEIB202质粒的消除 | 第33页 |
| 3.3.3 质粒消除株EIB202△p的验证 | 第33-34页 |
| 3.3.4 E.tarda EIB202△p的表型分析 | 第34-35页 |
| 3.4 实验结果 | 第35-37页 |
| 3.4.1 pEIB202质粒缺失验证 | 第35页 |
| 3.4.2 EIB202△p表型分析 | 第35-37页 |
| 3.5 讨论 | 第37-38页 |
| 3.6 小结 | 第38-39页 |
| 第4章 迟钝爱德华氏菌LPS合成相关基因序列分析 | 第39-45页 |
| 4.1 引言 | 第39页 |
| 4.2 分析材料及软件 | 第39-40页 |
| 4.3 分析结果 | 第40-43页 |
| 4.3.1 LPS脂质A合成相关基因分析 | 第40页 |
| 4.3.2 LPS核心寡糖合成相关基因分析 | 第40-41页 |
| 4.3.3 LPS O-多糖合成相关基因分析 | 第41-42页 |
| 4.3.4 waaL基因分析 | 第42-43页 |
| 4.4 讨论 | 第43-44页 |
| 4.5 本章小结 | 第44-45页 |
| 第5章 迟钝爱德华氏菌waaL基因的功能鉴定 | 第45-60页 |
| 5.1 引言 | 第45-46页 |
| 5.2 实验材料 | 第46-48页 |
| 5.2.1 菌株、引物及培养基 | 第46-47页 |
| 5.2.2 主要试剂、试剂盒及材料 | 第47-48页 |
| 5.3 实验方法 | 第48-53页 |
| 5.3.1 △waaL突变株的构建 | 第48-50页 |
| 5.3.2 回补菌株waaL~+的构建 | 第50页 |
| 5.3.3 压力应激性的测定 | 第50-51页 |
| 5.3.4 外膜蛋白提取 | 第51页 |
| 5.3.5 脂多糖提取 | 第51-52页 |
| 5.3.6 菌体沉降实验 | 第52页 |
| 5.3.7 溶血动态曲线的测定 | 第52页 |
| 5.3.8 侵染及内化 | 第52-53页 |
| 5.3.9 LD_(50)测定 | 第53页 |
| 5.3.10 竞争性实验 | 第53页 |
| 5.3.11 生物被膜实验 | 第53页 |
| 5.4 实验结果 | 第53-57页 |
| 5.4.1 E.tarda EIB202Δp ΔwaaL突变株及回补株waaL~+的验证 | 第53-54页 |
| 5.4.2 压力应激性 | 第54页 |
| 5.4.3 溶血素及生物被膜 | 第54-55页 |
| 5.4.4 细胞侵染、LD_(50)与竞争性实验 | 第55-57页 |
| 5.4.5 脂多糖与外膜蛋白 | 第57页 |
| 5.4.6 细胞沉降 | 第57页 |
| 5.5 讨论 | 第57-59页 |
| 5.6 本章小结 | 第59-60页 |
| 第6章 结论与展望 | 第60-62页 |
| 6.1 结论 | 第60-61页 |
| 6.2 展望 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-68页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
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