锯缘青蟹(Scylla serrata)是我国海水养殖经济蟹类的主要品种之一。锯缘青蟹昏睡病及清水病给青蟹养殖业带来巨大经济损失,其病原为锯缘青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovrirus,简称SSRV),迄今该病尚无有效治疗手段。本论文根据SSRV的RNA多聚酶基因序列设计引物,建立一种一步法逆转录PCR (reverse transcription PCR,简称RT-PCR),在一个反应管中完成逆转录和PCR扩增两个反应,一次完成SSRV RT-PCR检测,灵敏度达10-8μg纯化SSRV dsRNA。该方法灵敏度高,特异性强,操作简单,减少污染和假阳性发生,为SSRV检测、种苗筛查、宿主范围调查提供了一种可靠的方法。利用一步法RT-PCR对海洋甲壳、软体动物等进行了SSRV检测,在三疣梭子蟹、脊尾白虾、口虾蛄、缢蛏、菲律宾蛤仔、沟螺、贻贝、泥蚶等组织中检测到SSRV,其中三疣梭子蟹、菲律宾蛤仔、沟螺、泥蚶带毒率较高,分别为86.7%、90%、70%、90%；脊尾白虾、口虾蛄、贻贝、缢蛏带毒率也分别达到38.1%、50%、50%、30%；未分类的饲料杂鱼11个样品中也有1个检测到SSRV。提示养殖过程中应将锯缘青蟹与这些动物隔离,切断SSRV传播途径,避免以带毒动物作为饲料,消除传染源,减少SSRV相关疾病发生。克氏原螯虾(Procambarus clarki)和锯缘青蟹同属节肢动物门甲壳纲十足目,本论文从SSRV阳性锯缘青蟹肝胰腺组织制备SSRV悬液,经第三尾节腹部肌肉内接种健康克氏原螯虾,每2日取接种克氏原螯虾肝胰腺、鳃、肌肉和肠组织,以聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE)、一步法RT-PCR、组织切片HE染色显微观察、超薄切片电镜观察等进行检测。结果显示,接种克氏原螯虾肝胰腺、鳃、肌肉和肠组织中不仅经PAGE检测到SSRV特征性dsRNA图谱,一步法RT-PCR检测到SSRV基因,组织切片经苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,简称HE染色法)染色后显微镜下在鳃组织细胞中观察到典型呼肠孤病毒胞浆内包涵体,超薄切片电镜下也在肝胰腺组织细胞胞浆内观察病毒晶格结构。SSRV克氏原螫虾实验感染体系的初步建立,不仅可大量繁殖SSRV,为SSRV生物学和分子生物学研究提供实验材料,也为SSRV感染和复制机制提供平台,为SSRV相关疾病治疗靶点和药物筛查提供基础。
