滑膜肉瘤融合基因SYT-SSX及细胞外信号调节激酶通路调控细胞增殖的研究

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目的:研究滑膜肉瘤融合基因SYT-SSX的下游基因,筛选并明确其中部分基因在滑膜肉瘤发生发展中的功能与内在联系,从融合基因及下游基因的角度阐明滑膜肉瘤的发生发展机制,为临床治疗提供新的线索。方法:选取滑膜肉瘤细胞系SYO-1,构建特异性封闭融合基因SYT-SSX的siRNA真核载体,采用脂质体转染的方法,干扰并封闭融合基因的表达。利用Realtime RT-PCR的方法验证封闭效果。选取其中封闭效果良好的样本进行人类全基因组表达谱基因芯片分析。实验所得所有变化基因使用基于网络的基因分析工具,进行分类注释分析及代谢通路分析。选取其中一条与SYT-SSX密切相关的细胞代谢通路,Realtime RT-PCR验证其关键位点基因,在SYT-SSX封闭后mRNA表达水平的变化。Western Blot方法验证融合基因被特异性siRNA封闭后,细胞代谢通路关键位点的基因蛋白水平的变化。采用MTT染色活细胞数,评估细胞增殖活力,验证封闭SYT-SSX后,对于细胞的增殖的影响。PI染色,流式细胞仪检测细胞周期,同时检测细胞周期相关蛋白水平表达变化,验证SYT-SSX及所选通路对于细胞周期的影响。Annexin V-FITC和PI双染色,流式细胞仪检测细胞坏死与凋亡,初步探讨SYT-SSX与所选通路对于细胞凋亡的影响。同时,选取表达融合基因SYT-SSX及不表达融合基因的人体滑膜肉瘤及其它组织学类型肉瘤共74例,以免疫组织化学法及TUNEL染色方法,在蛋白水平验证体内环境中,SYT-SSX表达及所选通路蛋白与其下游功能蛋白之间的联系。应用统计学分析方法对所有结果进行计数资料的正态性检验、方差齐性检验,方差分析和t检验等,以P<0.05,差别具有统计学意义。结果:(1)构建的siRNA真核表达载体,在体外环境中可以特异性封闭融合基因SYT-SSX,并且在72h达到93.7%抑制率;(2)基因芯片检测结果全基因组表达谱基因芯片中375个基因上调,418个基因下调,所有变化的793个基因中653个可以进行基因功能分类,其中涉及蛋白磷酸化,细胞分裂,细胞周期,细胞转运,RNA结合,离子代谢,核蛋白代谢等。对所有变化基因进行细胞通路分析,5条通路被选中,其中ERK通路与SYT-SSX相关性最为显著(P<0.05);(3)mRNA水平及蛋白水平验证ERK表达量在封闭融合基因SYT-SSX后,有明显下降;(4)封闭融合基因SYT-SSX后,MTT法检测活细胞数封闭组明显低于未处理组,封闭组细胞周期调控出现明显GO/G1期阻滞,处于DNA合成期(S期)细胞明显减少。Western Blot结果显示细胞周期相关蛋白,CyclinD1表达量明显下降,CDK4表达变化不明显;(5)融合基因封闭后, Annexin V-FITC和PI双染色,流式细胞仪测定,凋亡细胞数明显高于阴性对照siRNA组及仅使用脂质体处理组;(6)免疫组化染色结果显示,表达SYT-SSX融合基因患者,具有较高的ki-67染色指数,体内环境中表达较高的p-ERK蛋白及CyclinDl及CDK4蛋白,而TUNEL染色显示凋亡指数组间差别无统计学意义;(7)免疫组化结果显示,表达较高水平p-ERK的患者,同时表达较高水平的ki-67染色指数,CyclinD1和CDK4蛋白表达量高于p-ERK表达水平较低的患者,而TUNEL染色凋亡指数组间差别无统计学意义。结论:(1)构建siRNA真核载体,在体外环境中可以高效率,特异性的抑制融合基因SYT-SSX的表达;(2)融合基因可影响细胞增殖,凋亡,分化发育的多种基因,其中ERK可能为其中重要的通路之一,融合基因通过ERK通路促进细胞增殖,调控细胞周期,在一定程度上抑制细胞凋亡,从而在滑膜肉瘤的发生发展中起重要作用。(3)体内环境中,SYT-SSX可以上调p-ERK蛋白表达,进而提高细胞增殖活性,对细胞周期发挥正向调控作用,与体外实验结果一致。
中文摘要第4-6页
Abstract第6-8页
缩略语第11-12页
前言第12-16页
    研究现状、成果第12-14页
    研究目的、方法第14-16页
一、融合基因SYT-SSX特异性siRNA表达载体构建及对滑膜肉瘤细胞系SYO-1生长的影响第16-34页
    1.1 对象与方法第16-23页
        1.1.1 实验材料第16页
        1.1.2 实验方法第16-23页
    1.2 结果第23-29页
        1.2.1 重组pBAsi-hU6 Neo载体验证第23-26页
        1.2.2 SYO-1细胞培养,融合基因鉴定及重组质粒转染第26-29页
    1.3 讨论第29-33页
    1.4 小结第33-34页
二、封闭融合基因SYT-SSX后下游相关基因的筛选和分析验证第34-60页
    2.1 对象与方法第34-39页
        2.1.1 实验材料第34页
        2.1.2 实验仪器第34-35页
        2.1.3 实验方法第35-39页
    2.2 结果第39-53页
        2.2.1 Realtime-PCR验证重组质粒干扰效果第39-41页
        2.2.2 基因芯片分析结果第41-44页
        2.2.3 基因芯片结果验证第44-47页
        2.2.4 MTT法测定融合基因SYT-SSX封闭后对于细胞增殖的影响第47页
        2.2.5 封闭融合基因SYT-SSX后对细胞周期的抑制第47-50页
        2.2.6 重组质粒转染后对于SYO-1细胞凋亡的影响第50-53页
    2.3 讨论第53-59页
    2.4 小结第59-60页
三、融合基因SYT-SSX及下游基因在滑膜肉瘤病例中的表达第60-73页
    3.1 对象与方法第60-64页
        3.1.1 病例选取第60页
        3.1.2 RT-PCR法检测SYT-SSX融合基因第60-63页
        3.1.3 组织芯片制作,免疫组化及TUNEL染色第63-64页
    3.2 结果第64-69页
        3.2.1 RT-PCR检测结果第64-65页
        3.2.2 免疫组化结果第65-69页
    3.3 讨论第69-72页
    3.4 小结第72-73页
全文结论第73-74页
论文创新点第74-75页
参考文献第75-83页
发表论文和参加科研情况说明第83-84页
综述 滑膜肉瘤中融合基因SYT-SSX研究进展第84-107页
    综述参考文献第98-107页
致谢第107页
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