螺旋藻藻蓝蛋白抗百草枯诱导大鼠肺纤维化的研究
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海洋是药物的宝库,近年来,随着海洋生物学研究的不断深入,发现许多海洋藻类含有多种特有的天然的药用活性物质。藻蓝蛋白(Phycocyanin, PC)主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数一些甲藻中,是藻胆蛋白的重要组分,在螺旋藻中的含量较高。研究表明,PC具有抗炎症、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤等生理活性,为螺旋藻在保健和药用领域的开发提供重要的依据。百草枯(Paraquat, PQ),是目前世界范围内应用最广泛的除草剂之一。随着在我国农业上的广泛应用,PQ中毒也日趋增多。PQ对人畜均有较强毒性,致死剂量小,发展快且无特效解毒药物,临床上病死率很高。肺为PQ中毒的主要靶器官,大剂量中毒常由于急性肺损伤所致的呼吸衰竭及心、肝、肾等多脏器功能衰竭而死亡;较小剂量的中毒往往引起迟发性的肺纤维化,病程相对较长,晚期多死于肺间质纤维化所致的呼吸衰竭。传统的糖皮质激素和细胞毒药物长期应用副作用大,疗效并不理想。因此寻找行之有效的治疗药物是目前医疗界迫切需要解决的问题。PQ的中毒是多系统、多器官、多水平的,中毒机制尚未完全阐明,但多数学者认为,其中毒机制在于氧化损伤。PC能有效地清除氧基自由基,有较强抗氧化能力,对小鼠或大鼠炎症模型具有明显的抑制作用。这些活性作用对PQ中毒有潜在的治疗效果。目前,海洋药物尚未用于中毒治疗学研究,本课题研究的主要目的旨在研究PC对抗急性PQ中毒引起的急性肺损伤和肺纤维化作用,以期为临床救治和探索海洋药物治疗急性中毒提供科学依据。本研究首先对钝顶螺旋藻中的PC进行了提取和纯化。采用磷酸盐缓冲液循环冻融联合超生波破碎法,50%硫酸铵沉淀获得PC,提取率达到13.2%。粗蛋白提取液再经过两次羟基磷灰石柱(HA)层析和sephacrylS-200HR凝胶层析对其进行纯化,纯度比(A620/A280)达到4.75。然后我们对PC抗PQ诱导肺纤维化进行了研究:(1)肺组织病理变化:①苏木精伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, HE):模型(PQ)组1-7d以急性肺泡炎为主要表现,3d时炎症表现最重,14-28d成纤维细胞增生,大量肺泡结构萎陷、破坏,胶原沉积,肺纤维化初步形成。PC组各观察点病理变化和模型组相似,但程度较轻。早期(3、7d)即肺泡炎期,肺泡渗出、细胞浸润少,中后期(14、28d)即肺纤维化进展和纤维化期,在胶原沉积,肺纤维化进展程度轻。②马松三色(Masson)染色:28d时模型组可见较多蓝色胶原沉积于支气管壁及肺泡间隔,蓝染面积百分比较对照组有显著性差异(P<0.01)。PC组蓝染胶原沉积较少,蓝染面积百分比较PQ组差异有显著性(P<0.05)。③电镜:PQ组:早期可见肺泡I型上皮细胞受损,纤毛脱失,基膜断裂,肺泡腔内有大量水肿渗出液,多见巨噬细胞,间质炎性细胞浸润;后期可见到肺泡间隔增厚,内含大量增生、肥大的肺泡n型上皮细胞,板层小体空泡化,多见异型核,肺泡隔内弹性纤维、胶原纤维和网状纤维多,胶原纤维增生明显。PC治疗后PQ中毒大鼠肺组织超微结构表现为肺泡炎及纤维增生减轻。(2)血清和肺组织均浆丙二醛(MDA)含量变化:染毒后,染毒大鼠血清和肺组织均浆MDA含量均明显升高(P<0.01),PC治疗后,各观察点PC组MDA含量升高程度明显低于PQ组(P<0.01)。(3)肺组织中羟脯氨酸(HYP)含量变化:染毒后,染毒大鼠肺组织均浆HYP含量均明显升高(P<0.01),PC治疗后,各观察点PC组HYP含量升高程度明显低于PQ组(P<0.01)。(4)血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力变化:染毒后,染毒大鼠血清中GSH-Px活力均明显降低(P<0.01),PC治疗后,各观察点PC组GSH-Px活力明显高于PQ组(P<0.01)。(5)血清和肺组织均浆超氧化物歧化酶(SOD)活力变化:染毒后,染毒大鼠血清和肺组织中SOD活力均明显降低(P<0.01),PC治疗后,各观察点PC组SOD活力升高,与PQ组相比差异显著(P<0.01)。(6)肺组织均浆细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)的蛋白水平变化:染毒后,染毒大鼠肺组织中TGF-β1的蛋白水平均明显升高(P<0.01),PC治疗后,各观察点PC组TGF-β1的蛋白水平降低,与PQ组相比差异显著(P<0.01)。(7)肺组织肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)的影响:染毒后,染毒大鼠肺组织中TNF-α的含量均明显升高(P<0.01),3d时肺组织中TNF-α的含量最高,其后逐渐降低,28d时肺组织中TNF-α的含量最低。各观察时间点,PC组大鼠肺组织中TNF-α的含量均低于染毒组(P<0.01)。NF-κBp65的结果与TNF-α相似,7d时肺组织中NK-κBp65的含量最高,其后逐渐下降。各观察时间点,PC组大鼠肺组织中NK-κBp65的含量均低于染毒组(P<0.01)。结果表明:PC可以提高肺组织SOD和血浆GSH-Px、SOD活性,降低肺组织HYP、MDA和血浆MDA含量,降低肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1的蛋白水平,抑制NF-κB亚基p65及TNF-α活性,减轻PQ中毒大鼠肺泡炎及后期纤维化程度,对PQ诱导的大鼠肺泡炎及肺纤维化具有显著的抑制作用,对PQ中毒有较好的治疗效果。该研究将为海洋药物治疗PQ中毒致肺纤维化提供新的思路。
摘要 | 第4-7页 |
ABSTRACT | 第7-10页 |
目录 | 第11-13页 |
第一章 引言 | 第13-51页 |
第一节 螺旋藻研究 | 第13-20页 |
1 螺旋藻的基础研究 | 第14-17页 |
2 螺旋藻的应用研究 | 第17-20页 |
第二节 螺旋藻藻蓝蛋白的研究 | 第20-51页 |
1 藻胆体 | 第20-21页 |
2 藻胆蛋白 | 第21-29页 |
3 PC 的提取和纯化 | 第29-31页 |
4 PC 理化性质 | 第31-34页 |
5 藻胆蛋白基因工程 | 第34-39页 |
6 藻胆蛋白的表达和调控 | 第39-42页 |
7 藻胆蛋白的生物学活性 | 第42-47页 |
8 藻胆蛋白的应用及开发 | 第47-51页 |
第二章 百草枯中毒研究进展 | 第51-67页 |
1 中毒机制 | 第51-54页 |
2 病理变化 | 第54-55页 |
3 病理生理 | 第55-56页 |
4 临床表现 | 第56-57页 |
5 诊断和中毒程度分级 | 第57-58页 |
6 治疗 | 第58-65页 |
7 PQ 中毒预后判断 | 第65-66页 |
8 展望 | 第66-67页 |
第三章 钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的提取和纯化 | 第67-82页 |
材料和方法 | 第67-73页 |
1 材料 | 第67-70页 |
2 方法 | 第70-73页 |
结果 | 第73-78页 |
1 PC 浓度测定 | 第73页 |
2 PC 提取率的影响因素 | 第73-75页 |
3 纯化结果 | 第75-78页 |
讨论 | 第78-82页 |
1 PC 的分离纯化 | 第78-80页 |
2 影响因素 | 第80-82页 |
第四章 藻蓝蛋白抗 PQ 诱导大鼠肺纤维化作用的实验研究 | 第82-117页 |
材料和方法 | 第83-90页 |
1 实验材料 | 第83-86页 |
2 实验方法和步骤 | 第86-90页 |
3 统计学分析 | 第90页 |
结果 | 第90-105页 |
1 大鼠行为变化 | 第90页 |
2 大鼠体重变化 | 第90-91页 |
3 大鼠肺组织病理学表现 | 第91-100页 |
4 病理肺泡炎及肺纤维化量化分级 | 第100-101页 |
5 肺组织中 HYP、MDA 含量及 SOD 的活性变化及干预效果 | 第101-102页 |
6 血清中 GSH-Px、SOD 活力和 MDA 的含量变化及干预效果 | 第102-104页 |
7 大鼠肺组织均浆 TGF-β1含量测定 | 第104-105页 |
讨论 | 第105-117页 |
1 PQ 诱导肺纤维化大鼠模型的复制 | 第106页 |
2 PQ 致肺纤维化机制 | 第106-109页 |
3 PC 对 PQ 中毒大鼠中毒症状及肺系数变化的影响 | 第109页 |
4 PC 对 PQ 中毒诱导大鼠肺纤维化模型肺组织形态学的影响 | 第109-110页 |
5 PC 对 PQ 中毒诱导大鼠肺纤维化肺组织 HYP 含量的影响 | 第110-111页 |
6 PC 对 PQ 中毒诱导大鼠肺纤维化肺组织均浆及血清 SOD 含量的影响 | 第111-113页 |
7 PC 对 PQ 中毒诱导大鼠肺纤维化血清 GSH-Px 活性的影响 | 第113-114页 |
8 PC 对 PQ 中毒诱导大鼠肺纤维化血清和肺组织 MDA 含量的影响 | 第114-115页 |
9 PC 对 PQ 中毒诱导大鼠肺纤维化肺组织转化生长因子-β1含量的影响 | 第115-117页 |
第五章 藻蓝蛋白对 PQ 诱导大鼠肺纤维化肺组织 TNF-α、NF-κ B 的影响 | 第117-140页 |
材料与方法 | 第118-124页 |
1 材料 | 第118-119页 |
2 实验方法 | 第119-123页 |
3 统计分析 | 第123-124页 |
结果 | 第124-132页 |
1 Western-blot 实验结果 | 第124-129页 |
2 免疫组化实验结果 | 第129-132页 |
讨论 | 第132-140页 |
1 PC 对 PQ 中毒诱导肺纤维化大鼠肺组织 TNF-α的影响 | 第133-135页 |
2 PC 对 PQ 中毒诱导肺纤维化大鼠肺组织 NF-κ Bp65 的影响 | 第135-140页 |
参考文献 | 第140-162页 |
发表及已完成文章目录 | 第162-163页 |
致谢 | 第163页 |
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