miR-367在RYR3基因靶序列的多态性影响乳腺癌的发病风险、钙化和预后

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乳腺癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)会影响癌症的发病风险和预后,但机制尚不是很清楚。微小RNA (microRNAs, miRNA)是一类高度保守的,内源的,单链非编码核苷酸序列,miRNA通过调节基因的表达参与了很多生物学过程,包括细胞增殖、细胞凋亡和肿瘤的形成。miRNA通常结合于靶基因mRNA的3’端非翻译区(3’-untranslated region,3’UTR)区域,来剪切mRNA或抑制mRNA的转录。研究者发现有越来越多与癌症和药物敏感性有关的多态位点是位于miRNA靶基因3’UTR的SNP,推测其原因是miRNA与不同基因型的3’UTR结合能力有区别。位于miRNA靶基因3’UTR结合区域的SNP代表了一类能调节miRNA与靶基因环路的遗传变异。以碱基互补原理为基础的生物信息学分析已经预测了一系列miRNA靶结合区SNPs,为进一步功能验证和病例对照研究提供了候选位点。目的近来,发现有一类单核苷酸多态位点通过影响miRNA对靶基因的调控,来影响癌症的发病风险和预后。在本项研究中,我们通过检测位于miR-367靶基因RYR3 3’UTR结合区域的多态位点rs1044129的基因型,来探究钙离子释放通道基因RYR3 3’UTR的SNP是否与乳腺癌的发病风险性、乳腺癌钙化和预后相关。从功能上验证miR-367与靶基因是否结合,rs1044129多态位点是否能影响miR-367对RYR3的调控,探究RYR3在乳腺癌细胞中发挥的重要作用和对临床医学的指导意义。方法这是一项以中国妇女为对象的病例-对照研究,对1532名乳腺癌患者和1605名健康人进行了SNP rs 1044129基因型检测。非条件logistic回归分析得出调整前后的比值比和95%可信区间。采用Kaplan-Meier曲线和Cox多因素分析评价不同基因型的生存状况。热力学模型预测和报告基因实验用来验证rs1044129对miR-367与RYR3结合的影响。在RYR3机制研究中,应用MTT实验检测细胞增殖,划痕实验评价细胞迁移,荧光染料法检测细胞内钙离子浓度。结果rs1044129 G等位基因型可以增加乳腺癌的发病风险(aOR,1.26;95% CI,1.02-1.54),并与乳腺癌钙化相关(OR,1.52;95% CI,1.21-1.90)。生存分析显示G等位基因型的乳腺癌患者预后差(P=0.036)。基于RYR3 mRNA 3’UTR和miR-367碱基互补原则和二级结构原理的热力学模型的预测结果显示miR-367与A基因型的结合能力高于G基因型。通过荧光素酶报告基因证实了rs1044129对miR-367与RYR3结合的影响。并在功能实验中发现RYR3作为钙离子通道对乳腺癌细胞生长、迁移、细胞内钙离子浓度的影响和细胞形态学的改变。结论rs1044129多态位点是一个新发现的影响miRNA调控靶基因的SNP,与响乳腺癌的发病风险、乳腺癌钙化和预后密切相关。
中文摘要第4-6页
Abstract第6-7页
缩略语/符号说明第11-13页
前言第13-17页
一、RYR3 3'UTR多态性与乳腺癌的相关性第17-43页
    1.1 对象和方法第17-29页
        1.1.1 研究对象第17-18页
        1.1.2 流行病学调查第18-20页
        1.1.3 标本采集和保存第20页
        1.1.4 实验材料第20-22页
        1.1.5 实验方法第22-27页
        1.1.6 统计学分析方法第27-29页
    1.2 结果第29-39页
        1.2.1 一般特征第29-30页
        1.2.2 乳腺癌环境危险因素第30-31页
        1.2.3 RYR3 rs1044129多态性与乳腺癌发病风险的相关性第31-34页
        1.2.4 RYR3 rs1044129多态性与乳腺癌临床病理特征的相关性第34-35页
        1.2.5 RYR3 rs1044129多态性与乳腺癌钙化的相关性第35-37页
        1.2.6 RYR3 rs1044129多态性与乳腺癌预后的相关性第37-39页
    1.3 讨论第39-42页
        1.3.1 RYR3多态性与乳腺癌发病风险相关第39-40页
        1.3.2 RYR3多态性与乳腺癌钙化相关第40页
        1.3.3 RYR3多态性与乳腺癌预后相关第40-42页
    1.4 小结第42-43页
二、miR-367对RYR3 3'UTRA/G基因型的调控第43-80页
    2.1 对象和方法第43-63页
        2.1.1 研究对象第43-44页
        2.1.2 实验材料第44-46页
        2.1.3 实验方法第46-60页
        2.1.4 空间结构和能量预测方法第60-63页
        2.1.5 统计学分析方法第63页
    2.2 结果第63-76页
        2.2.1 miR-367与靶基因RYR3 3'UTR的结合模型第63-71页
        2.2.2 双荧光素酶报告系统实验结果第71页
        2.2.3 基因型与乳腺癌组织RYR3和miR-367表达的相关性第71-73页
        2.2.4 细胞系转染miR-367下调RYR3的表达第73-76页
    2.3 讨论第76-79页
        2.3.1 miRNA与mRNA的结合过程第76-77页
        2.3.2 生物学实验鉴定miR-367与靶序列的结合第77-78页
        2.3.3 不同基因型乳腺癌组织RYR3表达水平的差异第78-79页
    2.4 小结第79-80页
三、RYR3基因对乳腺癌细胞生长和迁移的影响第80-105页
    3.1 对象和方法第80-92页
        3.1.1 研究对象第80页
        3.1.2 实验材料第80-84页
        3.1.3 实验方法第84-92页
    3.2 结果第92-100页
        3.2.1 Dot-Blot验证RYR3的表达第92-93页
        3.2.2 RYR3对乳腺癌细胞增殖的影响第93-94页
        3.2.3 RYR3对乳腺癌细胞迁移的影响第94-96页
        3.2.4 RYR3对乳腺癌细胞内钙离子浓度的影响第96-97页
        3.2.5 RYR3对乳腺癌细胞形态的改变第97-100页
        3.2.6 RYR3影响骨代谢通路基因第100页
    3.3 讨论第100-104页
        3.3.1 下调RYR3蛋白抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移第100-101页
        3.3.2 下调RYR3蛋白影响细胞内Ca~(2+)的代谢第101-103页
        3.3.3 下调RYR3蛋白改变细胞的形态第103-104页
    3.4 小结第104-105页
全文结论第105-107页
论文创新点第107-108页
参考文献第108-118页
发表论文和参加科研情况说明第118-120页
附录第120-124页
综述 乳腺癌GWAS研究进展第124-142页
    综述参考文献第133-142页
致谢第142-143页
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