迟缓爱德华氏菌弱毒疫苗的研制和免疫效果

迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)可引起鱼类的爱德华氏菌病(Edwardsiellosis)，导致出血性败血症。疫苗免疫是预防鱼类病害的重要手段。弱毒疫苗可有效刺激机体系统免疫应答，通过浸泡、口服途径提供有效的免疫保护，实用而高效。以弱毒疫苗为载体可研制鱼类多价疫苗。本研究构建了迟缓爱德华氏菌LSE40的多株基因缺失株，筛选了11株弱毒株并检测它们对鱼的免疫保护效果。初步鉴定了LSE40III型分泌系统(T3SS)效应蛋白EseG的分泌信号肽，为进一步以迟缓爱德华氏菌T3SS为异源抗原呈递途径构建弱毒迟缓爱德华氏菌疫苗载体，进而研制鱼类多价疫苗奠定基础。一、迟缓爱德华氏菌LSE40ΔaroA突变株的特征及免疫效果LSE40ΔaroA突变株缺失了编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因aroA。该突变株的细菌形态变长、分裂延迟，在TSB培养基的生长变慢、运动力和菌膜形成能力减弱，在DMEM培养基中不能自凝、3个T3SS输送器蛋白(EseB，EseC， EseD)的表达和分泌减弱，在鱼体内的存活能力下降，对鱼的毒力减弱。将LSE40ΔaroA以注射和浸泡途径免疫大菱鲆，可检测到免疫鱼的血清产生特异抗体，但免疫鱼不能抵抗致病性迟缓爱德华氏菌的感染。二、迟缓爱德华氏菌LSE40基因缺失株的构建及其毒力检测以迟缓爱德华氏菌LSE40的7个与毒力或营养相关基因(腺苷酸基琥珀酸合成酶编码基因purA，天冬氨酸-β-半醛脱氢酶编码基因asd，5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶aroA，T3SS调节蛋白编码基因esrB和装置蛋白编码基因esaC，T6SS装置蛋白编码基因evpH，RNA聚合酶sigma S调节蛋白编码基因rpoS)为靶基因，构建了2株单基因缺失株： LSE40ΔpurA，LSE40Δasd；7株双基因缺失株：LSE40ΔaroAΔesrB、LSE40ΔpurAΔesrB、LSE40ΔpurAΔaroA、LSE40ΔaroAΔesaC、LSE40ΔaroAΔrpoS、LSE40ΔaroAΔevpH、LSE40ΔesrBΔevpH；2株三基因缺失株： LSE40ΔaroAΔesrBΔevpH和LSE40ΔaroAΔesaCΔevpH。以蓝蔓龙检测LSE40ΔaroA和11株突变株的LD50，结果显示毒力下降了130-1000倍以上。三、迟缓爱德华氏菌弱毒株的免疫保护效果首先，以LSE40ΔaroA和11株弱毒株注射免疫蓝蔓龙鱼，发现LSE40ΔaroA、LSE40ΔaroAΔesaCΔevpH和LSE40ΔaroAΔesrBΔevpH三株弱毒株没有提供免疫保护；其他9株弱毒株提供21.7%-82.6%免疫保护率(RPS)。然后，取LSE40ΔaroA和有较高RPS的3株弱毒株LSE40ΔaroAΔesrB、 LSE40ΔaroAΔesaC和LSE40ΔaroAΔevpH浸泡免疫牙鲆，在免疫牙鲆的血清检测到特异性抗体效价，注射攻毒的RPS分别为0、45%、25%和20%，浸泡攻毒的RPS为0、100%、66.7%和66.7%。结果显示，LSE40ΔaroAΔesrB、LSE40ΔaroAΔesaC、LSE40ΔaroAΔevpH对牙鲆提供较好的免疫保护。最后，用LSE40ΔaroAΔesrB注射免疫大菱鲆，108和107cfu/ml免疫组的注射攻毒时免疫保护率分别为20%和10%，106cfu/ml免疫组不能提供免疫保护效果；以浸泡和口服途径免疫大菱鲆，均未能提供免疫保护。综合上述结果，弱毒疫苗对蓝蔓龙和牙鲆提供良好的免疫保护，对大菱鲆未提供免疫保护。四、迟缓爱德华氏菌T3SS效应蛋白分泌性信号肽的鉴定利用细菌的T3SS呈递异源抗原，可构建多价疫苗载体。本实验利用生物信息学方法预测分析LSE40T3SS效应蛋白EseG和输送器蛋白EseC的分泌性信号肽区域，构建待定分泌信号肽与内酰胺酶β-lactamase的融合表达载体，在迟缓爱德华氏菌表达，以westernblot检测融合蛋白的表达和分泌情况。结果显示，EseG的1-88aa具有分泌型信号肽的功能，为进一步研究以迟缓爱德华氏菌T3SS为异源抗原呈递途径打下基础。