天龙提取物对气道上皮离子通道的生理学作用及其拮抗H5N1禽流感病毒HA蛋白介导的肺损伤的意义

研究背景和目的:呼吸道病毒感染，如严重急性呼吸综合征（SevereAcute Respiratory Syndromes，SARS）、H5N1禽流感病毒感染（Influenza A virus subtype H5N1）、甲型H1N1流感病毒感染（InfluenzaAvirus subtype H1N1）等，为呼吸系统重大传染性疾病，具有传播迅速、易感性强、致死率高等特点，极大威胁了人们的健康。近来临床与实验研究证明，病毒介导的肺损伤是导致病人高死亡率的主要原因。但其中的机制目前尚不清楚。囊性纤维化跨膜转导调节因子（Cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator, CFTR）是定位于呼吸道上皮细胞顶膜面的环一磷酸腺苷（cAMP）依赖的氯通道，该通道功能的缺失会激活核转录因子（NF-κB）信号通路，介导内源性的炎症反应，导致肺损伤。我们在前期研究中发现，禽流感病毒表面蛋白HA可以抑制呼吸道上皮CFTR功能，释放大量的炎症因子及趋化因子，导致肺部免疫病理损伤。我院广东名中医邱志楠教授经验方天龙咳喘灵由青天葵、款冬花、法半夏、五味子、熟附子等十多味药组成，临床与实验室研究表明该复方制剂具有防治呼吸系统免疫炎症、抗病毒、促进正常气道上皮修复等功效。根据文献报道，天龙复方中多种组分均有提高细胞cAMP水平的效应。而且，我们前期研究发现：H5N1禽流感病毒HA蛋白能够抑制CFTR通道促进炎症反应。因此，我们推测天龙有效组分可能通过活化cAMP，激活HA抑制的CFTR氯通道，负性调节NF-κB炎症信号通路，具有拮抗病毒介导的肺损伤的作用。本研究采用短路电流技术调查了天龙提取物对气道上皮离子通道的生理学作用，探讨了H5N1禽流感病毒HA膜蛋白对呼吸道上皮cAMP依赖的CFTR通道及相关免疫炎症信号通路的影响及天龙提取物的干预作用。研究内容与方法：第一部分天龙提取物对气道上皮离子通道的生理学作用活体分离C57小鼠气道组织，分别在基底膜面（B）和顶膜面（A）加入天龙提取物，应用美国Physiologic Instruments公司VCC-MC8Multi Channel Voltage-CurrentClamp短路电流放大器和Acquire&Analyze II数据采集器系统及数据分析软件，观察在正常的K-H溶液、HCO3--free K-H、Cl-free K-H以及Cl-&HCO3--free K-H溶液中的短路电流反应；钠离子通道阻断剂、钙激活的氯离子通道（CaCC）阻断剂、腺苷酸环化酶抑制剂、PKA抑制剂预处理情况下，加入天龙提取物，观察短路电流反应；分别加入不同浓度的黄酮类化合物单体及腺苷等对照品及上述单体的混合物到顶膜面，观察短路电流反应。第二部分天龙提取物对禽流感病毒HA介导肺损伤的保护作用的离子通道机制用禽流感病毒膜蛋白HA单独刺激或者加入天龙提取物进行干预，观察小鼠气道上皮的基础电流状态。之后加入钠通道阻断剂Amiloride、CFTR激动剂Forskolin，记录各自短路电流反应；HA蛋白单独或者HA联合天龙提取物共同刺激16HBE细胞，用ELISA技术检测细胞内cAMP浓度改变情况、免疫荧光方法检测NF-κB的入核情况。结果：第一部分天龙提取物激活了气道上皮氯离子通道正常K-H液中，天龙提取物作用于小鼠气道上皮顶膜面时，能诱导一个快速、明显、持续时间较长的短路电流（Isc）反应，包括两部分，瞬时相以及维持相，反应呈浓度依赖性。钠离子通道阻断剂对此无影响，而钙激活的氯离子通道阻断剂、腺苷酸环化酶、PKA抑制剂H89预处理时，能够不同程度地抑制天龙提取物所诱导的Isc反应；另外，KH溶液中的HCO3—或Cl-被替代后，天龙提取物所诱导的Isc反应能被部分抑制；二者均被替代后，天龙提取物几乎不能引起Isc反应。提取物含有的黄酮类化合物或者甘草酸单独作用气道上皮时，可以诱导出短路电流变化，但较之天龙提取物明显弱小。混合物诱导的短路电流较较之单体化合物增强，但程度仍低于天龙提取物诱导的反应。第二部分天龙提取物对禽流感病毒HA介导的气道上皮CFTR通道抑制的拮抗作用用重组H5N1禽流感病毒HA蛋白预处理能明显降低小鼠气道的基础电流以及气道上皮细胞中cAMP的浓度，CFTR激动剂FSK所产生的短路电流反应增大，而天龙咳喘灵提取物的干预能在一定程度上拮抗上述反应。同时，免疫荧光染色结果发现，天龙咳喘灵提取物能显著抑制由HA蛋白刺激介导的NF-κB入核。结论：1、天龙提取物生理条件下激活气道上皮钙离子激活的氯离子通道和cAMP依赖的CFTR氯离子通道，诱导阴离子尤其是氯离子的分泌，产生一个明显的短路电流反应；这种短路电流反应是天龙提取物不同有效部位发挥整体协同作用的结果。2、天龙提取物可以通过多靶点、多途径提高细胞内cAMP的水平，激活H5N1禽流感病毒HA蛋白抑制的CFTR通道，负性调节NF-κB信号通路，发挥抗禽流感病毒介导的免疫损伤作用。