胶质瘤中miR-106b~25的表达及生物学作用机制的研究

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作为中枢神经系统最常见的难治性肿瘤,胶质瘤的治疗一直是神经外科的难题之一。在过去的几十年里,尽管胶质瘤的诊疗方法一直在不断改善,然而却成效甚微。从分子水平来全面理解胶质瘤的发生进展的机理,并在此基础上寻求有效的防治方法依然是当前胶质瘤研究的重点和难点。近年来的大量研究均显示出非编码RNA在多种生物学过程中具有重要调控作用。微RNA(microRNA, miRNA)是非编码RNA家族中被研究得最多的成员。目前,已经在多种疾病中发现异常的miRNA表达谱,尤其肿瘤。多种miRNA都在肿瘤的发生发展的过程中起着原癌或抑癌样的作用。寻找异常表达的:miRNA并探索其功能可为肿瘤的诊疗提供新的分子标签及靶点。我们之前对6个胶质瘤细胞系进行了microRNA表达谱研究,miR-106b是8个上调的miRNA之一。miR-106b与miR-93、-25共同组成了miR-106b-25基因簇。该基因簇与miR-17-92原癌基因簇为旁系同源。目前研究发现miR-106b-25基因簇的三个成员在多种肿瘤组织及肿瘤细胞系中都高表达,包括头颈部鳞癌、结肠癌、髓母细胞瘤、食管癌、多发性骨髓瘤、肝癌等,并且可以通过调控细胞周期、凋亡相关蛋白影响肿瘤细胞的生长和存活。miR-106b-25基因簇在胶质瘤中的表达及功能目前研究报道得还很少。在第一部分研究中,我们分别运用原位杂交和实时定量PCR的方法检测了包含正常脑组织和不同级别胶质瘤的组织芯片及手术新鲜切除的不同级别胶质瘤标本中miR-106b-25的表达。结果显示miR-106b-25的三个成员在胶质瘤中的表达高于瘤旁正常脑组织,并随着肿瘤级别增高,三种miRNA的表达呈增高趋势。8种胶质母细胞瘤细胞系中miR-106b-25的表达结果表明,该簇小RNA在体外培养的细胞系中表达也不同程度地增高。这些结果均显示miR-106b-25在胶质瘤中表达增高,并同肿瘤级别呈正相关,显示出其在胶质瘤的发展过程中可能发挥着一定的作用。三种:miRNA的定量表达的相关性分析结果表明三种miRNA的表达具有明显相关性,可能存在协同转录。第二部分研究中我们运用miR-106b、-93、-25的反义寡核苷酸作为抑制剂,在U251、LN229及TJ905胶质母细胞瘤细胞系中验证了miR-106b、-93、-25对胶质瘤细胞的生物学特性的影响及可能的机制。三种miRNA对胶质瘤细胞的生物学行为的调控作用既有协同作用,也在某些方面存在不同的作用。在细胞生长能力方面,单独抑制每个miRNA和联合抑制均可以导致胶质瘤细胞的周期阻滞、生长减慢、锚定非依赖性生长能力减弱,单独抑制与联合作用效果相似。但作用机制却存在差异,miR-106b、-93主要通过靶向p21抑制细胞周期进展而对胶质瘤细胞的生长呈抑制作用,不影响细胞凋亡,而miR-25主要通过靶向p57和Bim分别参与细胞周期和凋亡过程的调控来抑制胶质瘤细胞的生长。细胞侵袭能力检测结果显示抑制miR-106b、-93的表达可以明显抑制MMP2的表达而非MMP9来抑制细胞的侵袭能力。miR-25的抑制反而促进了细胞的侵袭迁移,但MMP2和MMP9均不受其表达的影响,表明可能存在其他的调控机制。AKT活性检测表明,三种miRNA均可以上调PTEN的表达而抑制p-AKT的活性。但EGFR表达结果却显示,只有miR-106b、-93抑制可以引起EGFR的表达下调,miR-25则无此作用。这些结果表明,miR-106b、-93与miR-25尚有不同的生物学作用机制,对肿瘤的生物学特性的影响也不尽相同。第三部分研究中我们运用生物信息学方法分析了miR-106b、-93、-25的预测靶基因的功能和信号通路聚集点,结果显示这三个:niRNA的生物学作用均首先集中在发育和分化过程,尤以miR-25为甚。除此外,miR-106b较倾向于磷酸化和非磷酸化及细胞增殖的过程,而miR-93则倾向于代谢的过程,miR-25则是转录调控和细胞间黏附的过程。我们进一步筛选并验证了RBL2为miR-106b和miR-93的直接作用靶点,并在miR-106b和miR-93参与的细胞生长调控过程中发挥了重要作用。第四部分研究我们验证了miR-106b-25反义寡核苷酸抑制剂对裸鼠皮下LN229胶质瘤细胞异种移植瘤的体内抑瘤效果。结果显示单独和联合原位注射miR-106b-25的反义抑制剂均可以明显抑制胶质瘤的生长,抑制miR-25可以促进细胞的凋亡。通过本研究证明了在胶质瘤中miR-106b-25基因簇存在异常高表达,表达程度与肿瘤的级别呈正相关。抑制miR-106b-25可以抑制胶质瘤细胞的生长。但三种miRNA对胶质瘤细胞生长抑制的机制却存在差异。并首次验证了RBL2为miR-106b、-93的直接调控靶基因,其在miR-106b、-93的胶质瘤细胞生长调控中发挥了重要作用。
中文摘要第4-6页
Abstract第6-8页
缩略语/符号说明第9-13页
前言第13-18页
    研究现状、成果第13-16页
    研究目的、方法第16-18页
一、miR-106b~25在胶质瘤中表达的研究第18-37页
    1.1 对象和方法第19-23页
        1.1.1 对象第19页
        1.1.2 方法第19-22页
        1.1.3 统计学处理第22-23页
    1.2 结果第23-35页
        1.2.1 组织芯片中miR-106b~25的表达第23-27页
        1.2.2 新鲜组织中miR-106b~25的表达第27-32页
        1.2.3 胶质瘤细胞系中miR-106b~25的表达第32-33页
        1.2.4 胶质瘤细胞系中miR-106b、-93、-25表达的相关性分析第33-35页
    1.3 讨论第35-36页
    1.4 小结第36-37页
二、反义miR-106b~25抑制胶质瘤细胞生物学行为的研究第37-68页
    2.1 对象和方法第37-44页
        2.1.1 对象第37-38页
        2.1.2 方法第38-44页
        2.1.3 统计学处理第44页
    2.2 结果第44-62页
        2.2.1 Real-time PCR检测转染后肿瘤细胞中miRNA的农达第44-46页
        2.2.2 流式细胞术分析转染后细胞周期分布的改变第46-49页
        2.2.3 MTT检测转染后细胞增殖能力的变化第49-52页
        2.2.4 Transwell实验检测转染后细胞侵袭能力的变化第52-54页
        2.2.5 Anexin Ⅴ检测细胞凋亡的变化第54-56页
        2.2.6 软琼脂克隆形成实验第56-59页
        2.2.7 Western blot检测相关蛋白的表达第59-62页
    2.3 讨论第62-66页
    2.4 小结第66-68页
三、反义miR-106b~25抑瘤机制的探讨第68-108页
    3.1 对象和方法第69-72页
        3.1.1 对象第69页
        3.1.2 方法第69-72页
        3.1.3 统计学处理第72页
    3.2 结果第72-103页
        3.2.1 生物信息学方法分析miR-106b~25基因簇成员的靶基因及功能第72-88页
        3.2.2 miR-106b~25对RB1家族成员的靶向调控作用第88-91页
        3.2.3 反义miR-106b、-93抑瘤机制的探讨第91-103页
    3.3 讨论第103-107页
    3.4 小结第107-108页
四、反义miR-106b~25抑瘤作用的体内研究第108-123页
    4.1 对象和方法第108-111页
        4.1.1 对象第108页
        4.1.2 方法第108-111页
    4.2 结果第111-118页
        4.2.1 miR-106b~25体内抑制异种移植胶质瘤生长情况第111-113页
        4.2.2 治疗后相关指标的变化第113-118页
    4.3 讨论第118-121页
    4.4 小结第121-123页
全文结论第123-124页
论文创新点第124-125页
参考文献第125-135页
发表论文和参加科研情况说明第135-136页
综述 miR-106b~25基因簇在肿瘤中的研究进展第136-143页
    综述参考文献第140-143页
致谢第143-144页
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