学习与记忆是两个相互联系的神经活动过程。学习是指动物通过运动,并依赖于获取的经验来改变自身行为以适应周围环境的神经活动过程。记忆是将学习到的信息贮存和读出的神经活动过程。按信息储存和回忆的方式分类,可以将记忆分为陈述性记忆和非陈述性记忆。然而这两种记忆的神经回路都需要边缘系统参与。海马区域就是边缘系统中的一部分,也在学习与记忆的神经元活动过程中扮演重要角色。从1950年起,科学家就已经注意到大脑海马区与学习记忆之间的关系。如果大脑海马区域受到损伤,那么受伤的病人往往表现出学习与记忆方面的功能缺失。经过多年研究,大量研究证据表明海马区是帮助人类处理长期学习与记忆声光、味觉等事件(即叙述性记忆)的主要区域。海马区域与学习记忆之间的密切关系的机制在于海马区域的神经细胞的活动。神经元细胞和神经胶质细胞是大脑中两类神经细胞。一直以来,人们都把研究重心放在神经元细胞上,认为神经元之间组成的网络是神经系统发挥作用的唯一途径,却忽略了数量比神经元细胞高10倍以上的神经胶质细胞。神经胶质细胞包括星型胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞等。最近研究表明,神经胶质细胞在神经系统中不单单是神经元细胞的辅助性的伙伴。它除了有营养支持的功能外,还可以调节神经元细胞间的化学突触的信号传播。例如当神经元细胞释放兴奋性神经递质谷氨酸时候,星型胶质上的代谢性谷氨酸受体就被激活,与谷氨酸受体偶联的IP3受体被激活,释放钙库中的钙离子到胶质细胞内,使得胞内的钙离子浓度升高,高浓度的钙离子激活CaMKⅡ,从而可以触发星型胶质细胞释放包括谷氨酸、ATP、PRO-BDNF和mBDNF等。这些信号分子可以传递给其他的星型胶质细胞,也可以反馈给神经元细胞,从而影响神经元细胞的突触效能。例如胶质细胞向突触释放谷氨酸盐,就能激活突触后膜上的NMDA受体,从而使得突触后膜发生去极化,使得突触后膜的神经元兴奋性突触后电流(EPSC)和兴奋性突触后电位(EPSP)增强。但是胶质细胞钙活动依赖的胶质递质传递释放参与突触可塑性的调节还是存在有争论的。争论的重点不在于胶质细胞钙信号的产生和胶质递质释放,而是胶质递质传递的机制及其是否为钙依赖以及胶质递质传递在突触可塑性中的作用。因而我们选用了沉默胶质细胞内钙信号的工具小鼠(IP3R2-KO)来进-步阐明是否胶质细胞通过钙依赖的释放递质来调控突触传递从而影响学习记忆功能,及其在突触可塑性中的作用。IP3(inositol1,4,5-triphosphate)为三磷酸肌醇。在细胞信号转导通路的过程中,磷脂酰肌醇信号通路中细胞外信号分子与细胞表面上的G蛋白偶联型受体结合,激活了质膜上的磷脂酶C (PLC-β),使得质膜上的4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解成1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DG)这两个第二信使,从而将细胞外信号转为细胞内信号。在细胞内,IP3与内质网(ER)上的IP3受体结合,从而打开钙离子通道,使得细胞内钙离子的浓度升高,进一步激活各类依赖钙离子的蛋白。IP3受体能调控细胞内钙离子的释放,并且广泛表达在哺乳类动物细胞上。IP3受体由四个亚基组成,根据组成的亚基不同可以将IP3受体分为三种亚型：IP3R1, IP3R2, IP3R3,这三种亚型分别为ITPR1, ITPR2, ITPR3基因编码合成。已有文章报道,这三种亚型受体与IP3的亲和力不一样：IP3R2>IP3R1>IP3R3。IP3R2受体和IP3的亲和力比IP3R1和IP3R3的亲和力强,而且IP3R2在海马区域中主要分布在神经胶质细胞内。既然IP3R2在神经胶质细胞调控钙离子浓度机制中扮演重要的角色,如果在小鼠大脑内敲除IP3R2,很有可能会影响神经元突触传递和小鼠的学习记忆功能。在神经系统中,神经元之间突触的连接强度是可变的,并非是固定不变的。这种可变性就被称为神经元可塑性。这种可塑性是神经突触之间的变化,是由于神经系统接收外界环境信息而产生的变化,往往变现为神经元间的连接强度的改变。所以神经元的可塑性往往被认为与学习记忆功能有着密切的关系。LTD和LTP (long terms-potential)被公认是神经突触可塑性的主要两种形式。LTD是一种能持久减少神经元突触功效的刺激。LTD在大脑很多区域的中枢神经系统具有不同的机制,而且具有不同的神经环路。如在海马区域,能诱导出LTD的有两条环路,一条环路是CA3上的神经元投射到CA1神经元上的神经环路；另一条环路是DG上的神经元投射到CA3神经元上的神经环路。而且这两条神经环路的机制也并非完全相同。LTD和学习记忆功能表达的关系是呈正相关还是负相关,现在还是存在有争议的。王玉田教授在近几年的研究表明海马区域的LTD是巩固空间记忆的必须条件[Hippocampal long-term]。而且无论是在体诱导的LTD还是离体的脑片上诱导的LTD,都通过激活NMDA受体,导致AMPA受体下膜而引起的LTD。张霞教授发表的大麻素通过调节胶质细胞的CB1受体介导海马LTD而导致工作记忆受损文章中提到,大麻素能激活胶质细胞上的CB1受体,然后胶质细胞释放出谷氨酸盐到突触中,激活突触后膜的NMDA受体,然后AMPA受体下膜,诱导出在体LTD,最终导致小鼠的工作记忆功能受损。这两项研究结果表明LTD对学习记忆功能肯定有重要的影响,但诱导出LTD对学习记忆功能是有利的还是损伤的,这个问题还存在有争议。通过张霞教授发表的研究结果可以看到,海马区的胶质细胞能够介导LTD的形成,从而进一步影响到实验动物的学习和记忆的功能表达。因此我们推想,在IP3R2-KO的小鼠海马区胶质细胞内部的钙库因缺少IP3R2,胶质细胞内的钙波消失,导致胶质细胞释放到突触的一些神经递质(如ATP,谷氨酸,GABA等)减少,从而影响到海马区域的LTD的形成,影响了海马介导的学习记忆功能,例如工作记忆,空间记忆,长时程记忆等。因此我们首先在电生理方面检测了海马CA3-CA1区的LTD (long terms-depression)是否正常。验证海马区的胶质细胞内的钙离子浓度是否对神经元的LTD具有重要的调节作用。通过实验证明,我们发现IP3R2-WT的小鼠海马区CA3-CA1的LTD能诱导出来(n=7),但是IP3R2-KO的小鼠海马区CA3-CA1的LTD却不能诱导出来,受损的(n=6)。诱导IP3R2-KO的小鼠海马区CA3-CA1的LTD时,在给完LFS后,10min-20min诱导出来fEPSP幅度逐渐地缩小,最后诱导出来的fEPSP幅度和前面30分钟记录基线的fEPSP幅度相基本持平,表现出LTD受损。前文已经提过,LTD和学习记忆的功能是呈正相关还是负相关的关系,现在还是存在有争议。所以我们在本实验中进一步通过与学习记忆相关的动物学实验来检测IP3R2-WT和IP3R2-KO老鼠在学习与记忆功能上是否存在差异。从而观察LTD受损的IP3R2-KO老鼠在动物学实验中是表现出学习记忆功能是增强了还是减弱,来判断LTD对学习记忆功能的影响。于是我们做了Morris水迷宫和Y迷宫这两个动物行为学实验。Morris水迷宫是英国心理学家Morris于20世纪80年(1981)代初设计并应用于脑学习记忆机制研究的一种实验手段。Morris和他的同事利用大鼠在盛有水和牛奶混合物的不透明水池中搜索目标物的方法,研究大鼠的海马等脑区受到损害后的学习、记忆和空间定向以及认知能力时取得了令人瞩目的结果。这种装置不但构思新颖、实验设计合理以及方法简便和实用,而且便于观察和记录动物入水后搜索藏在水下平台所需的时间、采用的策略和它们的游泳轨迹,从而可分析和推断动物的学习、记忆和空间认知等方面的能力。虽然起初的实验对象为大鼠,但此后该迷宫系统成为评估啮齿类动物空间学习和记忆能力的经典程序,广泛运用于神经生物学、药理学等领域的基础和应用研究中。它能较客观地衡量动物空间记忆、工作记忆以及空间辨别能力的改变。Morris水迷宫实验包括隐藏平台实验(Hidden platform test)、空间探索实验(Probe trials)、可视平台实验(Visible platform test)。隐藏平台实验主要检测实验动物的获取外界信息和经验能力,也就是学习能力；空间探索实验主要检测实验动物的对外界信息的记忆能力；可视平台实验主要检测外界条件如温度,实验房间里面摆设等对实验动物的影响。我们在本实验中通过Morris水迷宫检测IP3R2-WT小鼠和IP3R2-KO小鼠的学习与记忆能力是否存在差异。经过完成隐藏平台实验、空间探索实验、可视平台实验后,发现IP3R2-KO小鼠的在隐藏平台实验中的潜伏期比IP3R2-WT小鼠的要短,说明IP3R2-KO小鼠的学习能力比IP3R2-WT小鼠的学习能力要强。但是在空间探索实验中两者的探索总路径、原平台探索路径占总路径的百分比和原平台探索时间占总探索时间的百分比均没有统计学差异,但分析该数据可以看出IP3R2-KO小鼠要比IP3R2-WT小鼠空间记忆能力更好的趋势；可视平台实验中,两者的游泳速度没有差异,潜伏期也不存在统计学上差异。总结Morris水迷宫结果可以看出IP3R2-KO小鼠的空间记忆要比IP3R2-WT小鼠的要强。Y迷宫主要应用于动物的辨别性学习,工作记忆及参考记忆的测试。Y迷宫由三个完全相同的臂组成。根据分析实验动物进入各臂的次数、时间、正确次数、错误次数、路线等参数可以反映出实验动物的空间记忆能力。相对而言,Y迷宫简便、可行,相对八臂迷宫来说更加简单,有一定的实用性,现常用于学习记忆功能评价。Y迷宫实验模型用来研究啮齿类动物的空间识别记忆能力,这相对于被动回避等实验的优点在于：这种迷宫利用了啮齿类动物对新异环境天然探究的自然习性,不需要动物学习任何规则来趋利避害,能够有效地反映出动物对新异环境的识别记忆能力。为期三天的Y迷宫中,IP3R2-WT小鼠和IP3R2-KO小鼠的选择总次数没有存在统计学差异。在第二天的实验中,IP3R2-WT小鼠选择正确次数占选择总次数的百分比IP3R2-KO小鼠的百分比高。两者三天的百分比不存在统计学差异。综合以上结果,Y迷宫的检测结果表明IP3R2-WT小鼠和IP3R2-KO小鼠的学习记忆功能没有差异。综合上述的实验结果,我们发现IP3R2-KO小鼠海马CA1区的胶质细胞内的钙库“沉默”,导致CA1区的LTD受损,影响神经元的突触可塑性,从而影响该小鼠的学习记忆功能。Morris水迷宫实验表明IP3R2-KO小鼠比IP3R2-WT小鼠更聪明。因为调控小鼠的学习记忆功能的脑区除了海马区域外,还有前额叶皮层,杏仁核,纹状体等区域。虽然电生理结果显示IP3R2-KO小鼠海马CA1区的LTD受损,但并不能直接解析IP3R2-KO小鼠在Morris水迷宫中表现出比IP3R2-WT小鼠学习记忆能力要强的结果。因为IP3R2-KO小鼠是通过转基因把全脑中的IP3R2都敲除掉。有可能在该转基因小鼠大脑内多个脑区发上了变化,而我们只是检测到该小鼠的海马CA1区的LTD受损,还不清楚其它参与调控学习记忆功能的脑区是否有产生变化。所以我们猜测有可能是IP3R2-KO小鼠海马CA3-CA1和其它脑区共同调控该小鼠的学习记忆功能,也有可能是IP3R2-KO小鼠海马CA3-CA1的LTD受损结果和Morris水迷宫结果是两种平行性的关系。本课题的后续工作会通过检测特异性敲除海马CA1区神经胶质细胞内的IP3R2的IP3R2-loxp小鼠,观察该转基因小鼠是否同样出现LTD受损情况和Morris水迷宫表现学习记忆功能增强的结果。本课题结果提示IP3R2-KO小鼠海马CA1区胶质细胞内钙离子浓度升高受抑制,介导CA3-CA1的LTD受损,有可能增强了该转基因小鼠的学习记忆功能。
