以动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）为主要病理改变的心脑血管疾病严重威胁着人类。动脉粥样硬化发病机制复杂,目前得到广泛认可的为损伤-反应学说和由此发展的炎症理论。免疫机制在AS的形成、发展中起重要作用,多种参与免疫反应的细胞和分子相互协同、相互影响,促进了AS的发生发展。氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,oxLDL）在AS中的作用正日益受到重视。OxLDL是低密度脂蛋白（LDL）在体内发生氧化修饰而形成的,此反应与体内的氧化应激有关。LDL氧化修饰后,理化性质和生物学特性均发生了一系列改变,可以通过细胞毒性作用、化学趋化作用、影响血管平滑肌增殖、加速泡沫细胞形成、影响纤溶和凝血等机制促进AS的发生和进展。另外,oxLDL具有免疫原性,刺激机体免疫系统产生特异性自身抗体（oxLDL-Ab）。氧化低密度脂蛋白及其抗体均参与了动脉粥样硬化的发生发展,在疾病的进程中发挥着重要的作用,对其研究很多,但是,目前研究结论却有很大的差异,有些甚至十分矛盾。有些病例对照研究表明病人体内oxLDL和oxLDL-Ab水平显著高于正常对照,oxLDL的水平可提供重要的诊断信息,oxLDL-Ab可作为动脉粥样硬化的独立危险因素;然而也有研究报道oxLDL-Ab水平与动脉粥样硬化程度呈现负相关,oxLDL-Ab可发挥保护作用。这些相互矛盾的结果反映了动脉粥样硬化中免疫机制的复杂性。动脉粥样硬化是多阶段慢性演变的过程,包括血管内皮损伤、单核细胞和淋巴细胞粘附和侵入内皮转变为泡沫细胞、脂纹形成,平滑肌细胞迁移至内膜增生形成纤维斑块,之后逐步演变为粥样斑块,斑块不稳定或破裂导致临床上急性事件的发生等复杂过程。动脉粥样硬化斑块主要侵犯弹性型的大动脉和中等管径的动脉,其中颈动脉是脑供血的主要通路,此部位的粥样硬化斑块越来越多地被发现。颈动脉粥样硬化斑块导致狭窄从而引起血流动力学改变的并不多,相对来讲,粥样斑块的性质更为重要。病变若处于稳定期则影响不大,而不稳定时斑块溃破可直接导致脑卒中的发生。脑卒中具有高的病死率和致残率,对人体危险性很大。对不稳定斑块行外科手术切除为该病的二级预防提供了新途径。因此,对斑块稳定性的分析和研究非常重要。本文对确诊有颈动脉粥样硬化病变但病变处于稳定期的高危险性人群进行流行病学研究,分析血脂、ox-LDL、oxLDL-Ab及其它危险因素与颈动脉粥样硬化的关联,可为AS的防治提供基础,具有重要的现实意义。OxLDL可通过多种作用途径促进动脉粥样硬化的发生发展,其中诱导血管内皮细胞凋亡为其初始作用之一。细胞凋亡即程序性细胞死亡,是生物体内广泛存在的一种为维护体内稳态,细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后由特定基因控制的、以细胞DNA有控降解为特征的、无明显细胞溶解现象的细胞自主有序性死亡。细胞凋亡在AS的发生发展中发挥着重要的作用,尤其是内皮细胞的凋亡机制参与了动脉粥样硬化发生发展的各过程,可影响内皮细胞正常功能、促进血栓形成、参与血管重构、影响动脉形态与结构,具有重要意义。大蒜及从中提取的大蒜油具有广泛的药理作用,包括抗病原微生物、抗肿瘤、增强免疫系统功能、抗氧化、抗衰老、保护肝脏、防治糖尿病等,尤其可通过多种机制对心脑血管系统疾病产生显著的预防和治疗作用,其中,保护内皮细胞为其机制之一。人体必需微量元素硒（Se）也对心血管系统具有保护作用,其水平与心血管疾病的发病率呈明显负相关,还具有抗氧化、解毒等其他多方面生物学效应。大蒜和硒联合应用是否能发挥协同保护作用是该领域一直关注的问题。但是由于大蒜油的PH在5.3到5.8之间,而亚硒酸钠的PH为11.0左右,两者直接混合联用会破坏大蒜素;而且亚硒酸钠中的硒为无机硒,其在体内的吸收转换率难以确定。采用微胶囊技术可将大蒜油和硒联合,然而这种剂型很难用实验研究确定其效能。富硒大蒜的培育开发为将二者联合应用、评价其可能的保健或治疗作用提供了契机。已有研究证明,富硒大蒜可保护心脑血管系统,但具体机制目前尚未阐明,尤其对oxLDL所致的内皮细胞损伤的作用尚未见研究报道。因此,本文以山东苍山培育的富硒大蒜为原料,从中提取大蒜油,测定其中大蒜素和硒的含量;并用ox-LDL作用于体外培养脐静脉内皮细胞（ECV304细胞株）诱导其凋亡,进而用提取的富硒大蒜油进行干预,观察其对ox-LDL诱导的内皮细胞损伤的阻断作用,并对作用机理进行初步探讨。研究目的本文以颈动脉内膜增厚和/或有斑块形成、但未发生急性临床事件者为病例,以颈动脉正常者为对照,运用单纯病例研究和病例对照研究,分析血脂、ox-LDL、oxLDL-Ab及其它危险因素与颈动脉粥样硬化的关联,并分析oxLDL与自身抗体的关系,以了解与AS有关联的免疫机制,为AS的防治研究提供科学依据。用oxLDL作用于体外培养血管内皮细胞株ECV304,诱导其凋亡,进而用提取的富硒大蒜油进行干预,通过测定细胞存活率、细胞活性、细胞凋亡率及细胞凋亡相关蛋白的表达及其mRNA水平的变化以研究oxLDL对血管内皮细胞的损伤作用,探讨富硒大蒜油对此损伤的影响及可能机制,确定其是否有保护作用及所需剂量,为进一步研究其预防AS的功能提供基础。研究内容和方法一.oxLDL与动脉粥样硬化关系的临床观察研究1.研究对象的选择（1）单纯病例研究:选取2005年2月至2005年12月到山东省中医药大学附属医院特检科进行颈动脉超声检查,年龄40岁以上,了解后自愿参加本课题且两年后随访未发生急性临床事件的患者。入选标准为内膜增厚（IMT≥1.0mm）和/或颈动脉处至少一处可测量的斑块。排除严重肝脏或肾脏、甲状腺疾病、恶性肿瘤患者,以及两周内服用维生素B6、B12或叶酸、抗氧化剂者。（2）病例对照研究:病例来源同单纯病例研究;对照为同期参加检查的确诊无动脉粥样硬化病变者。所有研究对象均签署了知情同意书。2.颈动脉超声检查颈动脉超声检查由专人通过ESAOTE超声诊断仪操作。测量颈总动脉处的内膜中层厚度（IMT）。IMT≥1.3mm或比周围区域增厚50%以上即为斑块,并计算斑块的体积。3.调查测量内容及方法使用统一的调查问卷询问研究对象的姓名、年龄、性别、职业、月平均收入、文化程度、家庭住址、联系方式等一般情况以及吸烟情况、饮酒情况、锻炼身体情况、家族史等内容;测量身高、体重、血压等一般指标。4.实验检测内容和方法受试对象于清晨采集空腹肘静脉血约5ml,根据要求分离血清及血浆。2h内应用葡萄糖氧化酶法测量空腹血糖值;采用酶比色法测定甘油三脂（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）;采用放射免疫法（IRMA）测定血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）;采用乳胶增强投射比浊法测定脂蛋白（a）（Lpa）;采用固相酶联免疫吸附（ELISA）方法测定幽门螺杆菌IgG（Hp）、肺炎衣原体IgG（Cp）、巨细胞病毒IgG（CMV）抗体;采用ELISA方法测定oxLDL及oxLDL-Ab。5.统计方法统计分析所用软件为SPSS11.5和SAS9.0软件包。应用多元线性逐步回归分析和logistic回归分析探讨循环oxLDL和oxLDL-Ab的影响因素;应用广义线性回归分析IMT和斑块体积的影响因素;采用非条件logistic回归和判别分析进行病例对照研究中的多因素分析。二.体外阻断oxLDL对内皮细胞损伤的实验研究采用乙醇提取加橄榄油萃取法和水蒸气蒸馏加橄榄油萃取法分别从一般大蒜和富硒大蒜中提取大蒜油,同时制备大蒜匀浆,采用高效液相色谱法测定处理后不同组分大蒜素含量,氢化物发生原子荧光法测定其中的硒含量。采用铜离子诱导法将LDL体外氧化修饰成oxLDL,苏丹黑预染的琼脂糖凝胶电泳及TBARS测定法鉴定LDL氧化程度。应用水蒸气蒸馏加橄榄油萃取法所得大蒜油进行细胞培养实验。ECV304细胞常规培养于含10%新生牛血清的RPMI-1640完全培养液中,其中青霉素、链霉素浓度均为100U/mL,培养条件为37℃、5%CO2、饱和湿度。将处于对数生长期的ECV304细胞用0.25%胰蛋白酶消化,用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液调细胞浓度为2×104/ml,取适量细胞悬液接种于培养板或培养瓶。台盼蓝染色法检测细胞存活率;甲基四唑蓝（MTT）比色法检测细胞活性,求得10%的细胞生长受抑制所需要的一般大蒜油、富硒大蒜油及无机硒标准溶液浓度(IC10),选取低于IC10的浓度进行实验。实验分为8组:对照组、oxLDL组、一般大蒜油组、oxLDL+一般大蒜油组、富硒大蒜油组、oxLDL+富硒大蒜油组、硒标准溶液组、oxLDL+硒标准溶液组。所加一般大蒜油终浓度为5μl/L,富硒大蒜油终浓度为2.5μl/L,硒标准溶液终浓度为0.02μg/ml,oxLDL终浓度为22μg/ml。其中oxLDL+大蒜油组为先加入大蒜油作用24h后再加oxLDL作用。MTT法检测细胞活性,流式细胞仪Annexin V-FITC/PI染色法测定细胞凋亡率。对照组、oxLDL组、富硒大蒜油组、oxLDL+富硒大蒜油组瑞氏-吉姆萨染色光镜下观察细胞形态学改变,Western blot测定细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3的表达,反转录聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）检测Bcl-2、Bax和caspase-3mRNA水平的变化。研究结果一.oxLDL与动脉粥样硬化关系的临床观察研究1.单纯病例研究的结果（1）循环中oxLDL和oxLDL-Ab的相关性Spearman等级相关分析显示,循环中oxLDL和oxLDL-Ab之间没有线性关系。（2）循环oxLDL与动脉粥样硬化的关系Spearman等级相关分析可见循环oxLDL与IMT弱相关（rs=0.195,P=0.084）,而与斑块体积无关（rs=0.093,P=0.410）。而多因素分析显示oxLDL与IMT及斑块体积均无关。（3）循环oxLDL-Ab与动脉粥样硬化的关系Spearman等级相关分析可见循环oxLDL-Ab与IMT无关（rs=0.005,P=0.962）,与斑块体积也无关（rs=0.043,P=0.703）。多因素分析也显示oxLDL-Ab与IMT及斑块体积均无关。（4）动脉粥样硬化的影响因素在广义线性回归模型中,只有年龄和高血压是IMT及斑块体积的独立影响因素。2.病例对照研究的结果（1）循环oxLDL与动脉粥样硬化的关系病例对照研究显示,oxLDL为AS发生的危险因素。（2）循环oxLDL-Ab与动脉粥样硬化的关系病例对照研究显示,oxLDL-Ab在AS的发生中起保护作用。（3）动脉粥样硬化的影响因素病例对照研究中,控制各种混杂因素后,年龄、BMI、TC、TG、oxLDL为动脉粥样硬化发生的危险因素,其中TG的贡献最大（OR=7.399,95%CI:1.498-36.554）;而oxLDL-Ab有保护作用（OR=0.793,95%CI:0.714-0.880）。（4）颈动脉粥样硬化的预测采用逐步判别分析发现,oxLDL及oxDL-Ab对患有颈动脉AS病变均具有预测性。二.体外阻断oxLDL对内皮细胞损伤的实验研究1.大蒜素含量测定结果一般大蒜及富硒大蒜提取大蒜油后测定各部分大蒜素的含量,结果显示,橄榄油成功地将大蒜素萃取了出来,所得大蒜油中大蒜素含量较高。2.硒含量测定结果一般大蒜及富硒大蒜提取大蒜油后测定各部分硒的含量,结果显示,富硒大蒜中硒浓度高达一般大蒜的2609倍,且硒主要存在于水溶液中。应用水蒸气蒸馏加橄榄油萃取的方法提取大蒜油时,富硒大蒜油中硒的含量为一般大蒜油的142倍;硒的分布为剩余水溶液中最高,可占到全部量的71.42%。应用乙醇提取加橄榄油萃取法提取大蒜油时,富硒大蒜油中硒的含量为一般大蒜油的181倍;硒主要分布在萃取后的乳相中,达总量的48.76%。3.一般大蒜油、富硒大蒜油及无机硒对细胞生长的影响对数生长期的ECV304细胞在含有一般大蒜油或富硒大蒜油（终浓度均为2.5-40μl/L）或硒标准溶液（终浓度0.04-0.64μg/ml）的培养液中孵育,分别在24h、48h和72h收集细胞,计数200个细胞,结果示细胞存活率＞90%,此浓度范围的一般大蒜油、富硒大蒜油及硒标准溶液对细胞无明显的毒副作用。4.一般大蒜油、富硒大蒜油、无机硒及oxLDL对细胞活性的影响对数生长期的ECV304细胞在终浓度为5-320μl/L一般大蒜油或富硒大蒜油或0.04-2.56μg/ml硒标准溶液或10-160μg/ml oxLDL的培养液中孵育24-72h,经MTT检测细胞活性,结果显示一般大蒜油、富硒大蒜油、硒标准溶液及oxLDL对ECV304细胞活性的抑制均随时间的延长而增加,而且随着一般大蒜油、富硒大蒜油、硒标准溶液或oxLDL浓度的增加而增加。5μl/L一般大蒜油、2.5μl/L富硒大蒜油或0.02μg/ml硒标准溶液对正常细胞的活性几乎无抑制作用（抑制率分别为3.46%、4.86%、4.54%）,与对照组比较差异均没有显著性（P均＞0.05）;22μg/mloxLDL可明显抑制细胞的活性（抑制率为24.60%）,与对照组比较差异有显著性（P＜0.05）;用一般大蒜油、富硒大蒜油或硒标准溶液进行干预后,oxLDL所致的细胞活性抑制均明显降低（抑制率分别降低到7.23%、3.70%、5.68%）,与oxLDL组比较差异均有显著性（P均＜0.05）。5.富硒大蒜油及oxLDL对细胞形态的影响经瑞氏-吉姆萨染色后,油镜下观察发现,对照组ECV304细胞核大而圆,结构完整,细胞形态规则。OxLDL使细胞变得不规则,并出现凋亡改变。先加入富硒大蒜油作用24h后再加入oxLDL,细胞形态学基本正常,仅有少数细胞出现凋亡改变。6.一般大蒜油、富硒大蒜油、无机硒及oxLDL对细胞凋亡的影响应用Annexin V-FITC/PI染色法检测细胞凋亡率的变化,结果oxLDL组凋亡率相对于对照组显著增大,差异有统计学意义（P＜0.05）;在实验所用剂量下,一般大蒜油、富硒大蒜油及硒标准溶液组细胞凋亡率与对照组相比均没有显著性差异（P均＞0.05）;但一般大蒜油、富硒大蒜油或硒标准溶液均可抑制oxLDL所致的细胞凋亡率的增加,细胞凋亡率与oxLDL组相比均有显著性差异（P均＜0.05）。7.oxLDL及富硒大蒜油对细胞Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白表达的影响Western blot结果显示,与对照组相比,oxLDL组细胞Bax和caspase-3蛋白表达量均明显升高,而Bcl-2蛋白表达量显著降低。先加入富硒大蒜油作用24h后再加入oxLDL,Bax和caspase-3蛋白表达量均较oxLDL组显著降低,而Bcl-2蛋白表达量显著升高,均接近于对照组。8.oxLDL及富硒大蒜油对ECV304细胞Bax、Bcl-2和caspase-3 mRNA水平的影响RT-PCR结果显示,oxLDL能显著降低ECV304细胞Bcl-2 mRNA水平（16.1%,P＜0.05）,升高Bax mRNA水平（17.5%,P＜0.05）和caspase-3 mRNA水平（61.0%,P＜0.05）,同时使Bcl-2/Bax比值降低。先加入富硒大蒜油作用24h后再加入oxLDL,Bcl-2 mRNA水平升高了11.1%,与oxLDL组相比有显著性差异（P＜0.05）;BaxmRNA水平降低了2.9%,虽然与oxLDL组相比差异不显著（P＞0.05）,但其水平与对照组已无差异（P＞0.05）;caspase-3 mRNA水平降低了25.7%,与oxLDL组相比有显著性差异（P＜0.05）,但仍显著高于对照组（P＜0.05）;Bcl-2/Bax比值升高,相对接近正常水平。结论1.对于颈动脉粥样硬化病变稳定期的病人,体内血液循环中的氧化低密度脂蛋白（oxLDL）与其自身抗体（oxLDL-Ab）水平无关。2.血液循环中的oxLDL在颈动脉粥样硬化病人体内显著高于对照,但在稳定期病例中与病变的程度无关。3.血液循环中的oxLDL-Ab在颈动脉粥样硬化病人体内显著低于对照,但在稳定期病例中与病变的程度无关。4.oxLDL及oxLDL-Ab可预测AS的危险性,可作为高危人群是否需要进行AS斑块检查的初筛指标。5.oxLDL具有明显的细胞毒作用,可以诱导血管内皮细胞凋亡,此作用可能是通过影响Bcl-2、Bax和caspase-3的基因转录水平从而改变其蛋白表达量而引起的,这是oxLDL致动脉粥样硬化的初始作用环节之一。6.富硒大蒜油在较低浓度范围内即能够抑制oxLDL的细胞毒性作用,通过作用于基因转录水平而逆转Bax、Bcl-2和caspase-3的蛋白表达,从而抑制了oxLDL诱导的血管内皮细胞凋亡,对内皮细胞起到保护作用,参与抑制AS的发生。
