食品模拟体系糖化反应过程中羧甲基赖氨酸的形成和抑制

食品加工过程美拉德反应在改变食品组分的结构和功能的同时也产生了部分不可忽视的有害物质。在众多美拉德反应产物中，以羧甲基赖氨酸（CML）为代表的晚期糖基化终末产物（AGEs）已经证实与糖尿病等疾病都存在着千丝万缕的关系，CML潜在的危害性已越来越受到食品科技界的关注。国际食品科技领域关于CML的研究主要集中在CML生理医学方面，对CML的分析方法和毒性等方面的研究取得了一些进展，然而，针对食源性CML在食品加工过程中形成机理的研究则寥寥无几。本文将研究食品模拟体系糖化反应过程中有害物质CML的形成和演化的量化方法，在此基础上，确定食品加工过程中CML控制、抑制和消除策略。首先，本文建立了快速和精确检测食品模拟体系中CML的HPLC－MS检测方法。采用HPLC－MS检测CML的重现性好，精密度高，CML的检测定量限（LOQ）可以达到50ng/mL。采用此方法用于定量检测本文食品加热模拟体系中的CML。然后，研究微波和传统加热方式下的食品模拟体系糖化反应过程中CML生成的宏观变化规律。研究发现，在美拉德反应中还原糖更有利于生成CML，不同的糖生成的CML总量的顺序为：乳糖>葡萄糖>蔗糖。而且，微波加热相对于传统加热能够生成更多的CML。其次，在了解CML生成规律的基础上，本文探讨了形成CML的中间产物乙二醛和果糖基赖氨酸的生成规律和相互之间的联系。研究发现，CML中间产物果糖基赖氨酸能够生成乙二醛，说明果糖基赖氨酸不仅是形成CML的中间产物，同时也是生成CML中间产物乙二醛的前体物质。同时，基于CML的中间产物乙二醛形成于美拉德反应的所有阶段，本文提出了新的观点，即CML不仅产生于糖化反应的终末阶段，而且产生于糖化反应的开始阶段，在理论上可以将CML称为糖化过程的产物。本文采用碳标记示踪技术（CAMOLA）研究CML中间产物参与复杂的化学反应，通过合成13C标记CML，重点研究了CML形成的复杂路径。不同于传统观点认为CML分子上的羧甲基仅来自于葡萄糖残基的C－1和C－2位基团，本文研究发现CML中羧甲基的来源有两个途径：（1）果糖基赖氨酸分子中的葡萄糖残基的C－1和C－2位基团参与了CML分子上的羧甲基的形成；（2）葡萄糖氧化裂解的过程中，C－1和C－2位基团，C－3和C－4位基团，C－5和C－6位基团分别参与了乙二醛的形成，来自于葡萄糖残基不同基团的乙二醛与赖氨酸反应生成了CML，在此生成CML的路径中，CML中羧甲基分别来葡萄糖残基的C－1和C－2位基团，C－3和C－4位基团，C－5和C－6位基团。在此基础上，本文提出了CML形成的新途径，拓展了研究CML在食品加工过程中形成的新领域。研究还发现在葡萄糖和氨基酸的微波加热模拟体系中，CML中间产物果糖基赖氨酸的生成量和生成速率明显高于乙二醛，而且通过中间产物果糖基赖氨酸生成CML的总量远远大于通过乙二醛。结合13C标记的CML和CML中间产物的变化，本文认为无论是从形成CML的中间产物果糖基赖氨酸和乙二醛的生成量，还是从通过此两种路径形成的CML的总量角度研究，在葡萄糖和氨基酸加热体系中果糖基赖氨酸是生成CML的主要中间产物，乙二醛是次要中间产物。因此，不同于传统观点认为通过中间产物乙二醛生成CML的路径是主要路径，本文认为通过中间产物果糖基赖氨酸生成CML的路径是主要路径。另外，本文首次采用了多级动力学模型考察CML的形成动力学规律。研究了反应底物葡萄糖和赖氨酸，中间产物果糖基赖氨酸和乙二醛，反应终产物CML和类黑精等的反应速率、形成速率和降解速率。通过多级动力学模型较为全面阐述CML的形成机理。中间产物果糖基赖氨酸产生的反应速率常数大于生成乙二醛的反应速率，生成果糖基赖氨酸的活化能Ea低于生成乙二醛的活化能，说明食品加工过程中更容易生成中间产物果糖基赖氨酸，而且果糖基赖氨酸生成CML的转化率大于高于乙二醛，进一步证实了果糖基赖氨酸是形成CML的主要中间产物。最后，本文研究三种维生素（维生素B1，维生素C，维生素E）和两种黄酮类物质（芦丁和槲皮素）以及还原剂硼氢化钠对葡萄糖和赖氨酸模拟体系中CML生成的抑制效果。维生素C和维生素E对CML生成的没有抑制效果。维生素B1的氨基与氨基酸或蛋白质中的赖氨酸残基存在竞争的关系，竞争还原糖的羰基，抑制CML的生成。硼氢化钠对羰基化合物具有很强的还原能力，终止其氧化裂解生成CML。芦丁和槲皮素特有的酚羟基苯环结构具有强抗氧化能力，能够抑制CML的生成。通过结合CML生成的多级动力学模型研究发现，黄酮物质芦丁抑制CML的生成主要发生在糖化反应第二阶段，即中间产物的生成和转化为CML的阶段。