混合型肝细胞—胆管细胞癌发生机制及临床意义的研究

【研究背景及目的】在多种慢性肝脏疾病情况下，成熟肝细胞的由于氧化应激（oxidative stress）或老化（senescence）的作用，增殖能力受到抑制或者衰竭。隐藏于赫令管（canals of Hering，CoH）的干/祖细胞组分激活。这些细胞增殖能力增加，扩增形成胆管反应（ductular reaction，DR）。胆管反应已经被证明与炎症坏死程度和纤维化程度密切相关。尤其是胆管反应中中间型肝-胆管细胞（intermediatehepatobiliary cells）可产生促纤维化因子，或通过其他胆管细胞依赖的机制刺激纤维化的发生发展。因为大部分慢性肝脏疾病都是原发性肝癌的强烈致病因素，目前普遍认为肝祖细胞成分的激活与肝癌发生关系密切。一个已经被热烈讨论了几十年的假说认为：肝祖细胞在慢性肝炎情况下是潜在的癌变靶点；另外，一部分肝脏肿瘤被认为来源于肝祖细胞。肝癌的祖细胞样表型提示该肿瘤的祖细胞起源，并且这一表型常常与较差的预后存在相关性。近年来，这些干/祖细胞样肿瘤表型被归因于肿瘤的异质性（heterogeneity）。越来越多的证据支持这一异质性和一个目前并没有被广泛接受的肿瘤细胞亚群——肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）存在相关。虽然证据还并不充分，许多研究者认为肿瘤干细胞被是肝癌的组成部分。肿瘤干细胞是具备较强的肿瘤克隆形成能力和分化能力的肿瘤细胞亚群，肝细胞癌的某些亚群曾被证明具备这一特征。肝细胞癌中肿瘤干细胞亚群的起源目前还不清楚。肝干细胞可能通过恶性转化产生肿瘤干细胞。另外，祖细胞作为部分分化的转化增殖细胞，也可能遭受恶性转化而后具备干细胞特征。一旦肿瘤灶形成，肿瘤干细胞如同他们对应的良性细胞——干细胞，发生自我更新或分化为不同的其衍生肿瘤类型，例如，肝细胞癌或胆管细胞癌。它们共同组成了不同类型的肝癌。混合型肝细胞-胆管细胞癌是一种同时包含肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma, HCC）和胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocellular carcinoma, ICC）成分的原发性肝脏肿瘤。1903年Wells首次描述了5例包含肝细胞性肝癌成分及胆管细胞癌成分的肝脏原发恶性肿瘤，1949年Allen和Lisa进一步提出了CHC的病理分型方法。A型：HCC和ICC同时出现在同一个肝脏的不同部位，即双结节肿瘤；B型：HCC及ICC在位置上相连，并且在生长的过程中相互混合，即双结节融合型肿瘤；C型：HCC及ICC有相同起源，两种成分混合生长于同一肿瘤中，即混合型。1985年Goodman通过24例病检标本的观察提出了另一种病理分型方法。I型：碰撞型,即同一肝脏中发生了明显可认的HCC及ICC两种肿瘤，随生长碰撞融合；II型：移行型，即同一肿瘤中可见典型的HCC成分移行过渡为典型的ICC成分；III型:纤维板层样型，类似于HCC中的纤维板层样肝癌，但伴有可产生黏液的胆管样结构。世界卫生组织（WHO）的诊断标准根据起源的不同，将双结节肿瘤排除在混合型肝细胞-胆管细胞癌诊断之外。虽然相对罕见，混合型肝癌仍然由于其独特的临床病理学特征而吸引了广泛的关注。其主要表现为潜在的祖细胞起源，较强的侵袭性和较差的预后。目前，祖细胞相关的肿瘤表型已经在形态学和免疫学表型的观察中被证实。另外，一些临床特征与生存的相关性也曾被阐述。但是，其病理学特征与临床预后的关系目前还没有被阐明。而且，混合型肝细胞-胆管细胞癌具备显著的细胞学异质性，为研究祖细胞与临床病理学特征的关联提供了良好的模型。因此，我们对80例肝切除术混合型肝细胞-胆管细胞癌病例展开了以祖细胞相关特征为重点的临床病理研究，旨在发现这些临床病理特征与临床治疗转归之间的联系。该研究基于常规的免疫组织化学技术，采用精确到特定组织学结构的先进量化方法。最终我们应用高级的统计学方法将量化的组织学指标和其他临床病理学资料以及临床转归进行关联，以期探索这些指标对临床预后的预测意义以及探讨影响预后的可能机制。【病例和方法】1.病例和临床数据我们收集整理了1997年到2003年间80例术后病理确诊为混合型肝细胞-胆管细胞癌病人的临床资料，包括：病人的基本资料（年龄、性别等）、病原学因素（病毒性肝炎感染史及相关检查指标、饮酒史、血吸虫感染史）、血常规指标、肝功能指标（总胆红素、直接胆红素、AST、ALT、ALP、GGT）、肿瘤标志物（AFP、CA19-9、CEA）及影像学资料（CT、MRI或B超所见）。病人的手术资料，包括手术方式、切除范围术前影像学、术中所见及术后病理。肿瘤的分级按照UICC2009年公布的第7版TNM分期进行分级。我们定义根治切除为肿瘤距切缘2厘米，术后1月内B超或CT检查提示无明显复发迹象。2.术后随访和复发的检测80例自手术后每2-3个月接受随访观察患者复发和生存的情况，2008年7月结束本研究随访。随访常规进行血清肿瘤指标的检测（AFP、CA19-9）或腹部B超检查。血清AFP或CA19-9水平显著升高和/或腹部超声探测到肝内新生肿块提示复发，并通过增强CT的特征性表现或胆管成像（MRCP，ERCP）明确复发诊断。病人入院接受进一步检查和治疗，包括外科手术切除、射频消融（RFA）、肝动脉化疗栓塞术（TACE）或支持治疗。患者总生存（overallsurvival， OS）定义为手术日期到病人死亡日期的时间间隔。无瘤生存（disease-free survival，DFS）定义为手术日期到病人第一次确诊复发日期的时间间隔。如果未确认复发，病人则被归入截尾状态列入统计分析，日期以最后一次随访或患者死亡日期为准。3.组织学诊断和分析按医院病理科常规方法进行标本固定、取材、包埋以及手术标本的存放。手术后，分别于肿瘤和肿瘤边缘、癌与癌旁瘤、非肿瘤正常区域进行取材和石蜡包埋。每个病例所取蜡块的数量由肿块大小决定。对于肿瘤较大的病例，取材根据大体观察及患者临床特征决定，选取多个典型区域，不对所有肿瘤部位进行全面取材。苏木素-伊红及AB-PAS染色根据文献描述进行。混合型肝细胞胆管细胞癌的组织学诊断主要依据WHO诊断标准并参考Maeda等的建议。HepPar1、K18、K7和K19染色作为辅助诊断指标。因为有些病例肝细胞癌区域的分化程度不同，体现出极大的组织学异质性，要确定其分化程度显得极为困难。为此我们将具备“多中心发生”特征的群体定义为：（1）至少存在两个肿瘤结节，其中一个表现为高分化肿瘤位于不典型增生结节（dysplastic nodule，DN）中，呈现“节中节”（nodule in nodule）表现；（2）中等或低分化肿瘤结节存在高分化的边缘部分。癌旁组织的肝炎肝纤维化水平采用Ishak提出的系统进行评估。4.免疫组织化学及评估所有的免疫组织化学检测均在4微米切片上进行。用计算机辅助的染色强度分析来评估各种指标的表达。5个200倍视野被随机选取和拍摄，并利用软件读取照片的总体光密度（Integrated Optical Density，IOD）。标本上显示坏死、结构破坏或边缘部分被排除在分析范围之外。AFP的间质染色也被尽量排除。由于光密度总体为非正态分布，可用Box-Cox转换将这些数据转换为正态分布，以便于后续分析。在肿瘤中，PCNA增殖指数可用来描述肿瘤细胞的增殖程度，定义为PCNA阳性细胞核数量与总肿瘤细胞数量的比值。5.胆管反应的评估我们用癌旁组织切片中K7染色的情况来来评估汇管区的实质-间质交界处的胆管反应。具体为，反应胆管细胞（reactive ductular cells）的评估基于其涵盖肝实质-间质界面的比例。对于尚未形成完整显微间隔的病例，评价汇管区区域RDCs所占肝实质-间质界面的比例。而对于已经形成纤维间隔的病例，评价假小叶周围RDCs所占肝实质-间质界面的比例。主观评价结果分以下5个等级：0，无；2，1+，≤10%；2+，10%到25%；3+，26%到50%；4+，≥50%。K7阳性的中间型肝细胞-胆管细胞（intermediate hepatobiliary cells, IHBCs）按照Roskams提出的方法进行半定量评估。OV-6阳性肝细胞的评估采用计算机辅助计算肝细胞OV-6的表达强度。另外，PCNA被用来评价RDCs的增值状态。相邻连续切片分别染色PCNA和K7，分别取5个相同视野，计数RDCs细胞PCNA阳性细胞核。胆管反应的增殖指数（Proliferative index of DR，PI-DR）指PCNA阳性细胞数与RDCs总数的比值。6.抗原共定位研究用免疫荧光双重标记技术研究抗原在细胞中的共定位。祖细胞/胆管细胞标志物采用绿色荧光标记（Alexa Fluor488），未成熟肝细胞标志物AFP采用红色荧光标记（Alexa Fluor568），干/祖细胞标志物c-Kit也采用红色荧光标记。荧光显微镜在相同视野拍照叠加后，抗原共定位显示为黄色或橙色。7.统计学方法所有连续变量在接受进一步统计学分析之前都接受正态性检验。正态分布连续变量用均数±标准差表示。非正态分布连续变量用中位数和范围表示。用方差分析（多组）或student’s t检验（两组）进行均数的比较分析，多组间的多重比较用Dunnett’s检验。对于非正态分布数据的比较，我们使用Mann-WhitneyU检验。两组变量的相关性根据其数据分布类型的不同采用Spearman或Pearson相关性检验。生存分析采用Kaplan-Mayer法，Log-Rank检验提供统计学差异。多因素分析方面，针对因变量的不同采取不同方法。因变量为正态分布连续变量时，采用多元线性回归的方法；因变量为两分类变量时，使用Logistic风险回归；当因变量为生存指标时，采用Cox比例风险回归。变量的选择主要根据单因素实验结果和既往文献报道，同时考虑变量间的共线性（Collinearity）。特别的，Cox比例风险回归入选KM法p<0.10的变量。多元回归采用逐步回归法，采用回退法筛除无统计学意义变量，最大似然法估计参数。所得模型的拟合优度（goodness of fit）采用计算R2(多元线性回归)、ROC曲线下面积（Logistic风险回归）或偏残差/Schoenfeld残差（Cox比例风险回归）。所有统计学分析均采用SPSS12.0（SPSS Inc., Chicago, IL）或R软件(RFoundation, Vienna, Austria)。P<0.05被认为有统计学差异。【结果】1.临床、组织学以及随访数据80例病例中，男女比例为9:1。85%的病人合并HBV感染，55%的病人基础疾病为HBV感染相关的肝硬化。术前血清肿瘤指标检查，75.9%的患者AFP升高，23.0%的患者CA19-9升高，10.7%的患者CEA升高。肿瘤数目从一个到四个不等，术前诊断多个肿瘤的患者占32.5%，肿瘤最小直径1.9厘米，最大直径15.8厘米，平均直径6.2厘米。肿瘤的在肝脏中的分布以肝右叶居多。手术切除过程中，1例可见肿瘤破裂，横膈膜侵犯3例，腹腔播散1例，淋巴结转移并被病理明确2例；另有1例可见胆管主干癌栓，病人接受姑息性切除。门静脉或肝静脉癌栓见于17.4%的患者，手术中采用癌栓手术切除或吸除。8例病人采用姑息性手术，2例病人发生手术后肝功能衰竭。这10例病人的中位生存时间仅为88天，故被排除出根治切除组。长期随访过程中，3例病人在2005失访。70例接受根治切除的病人的总体1、3和5年生存率为74.3%，38.6%和30%，无瘤生存率为41.1%、18.6和10.0%。64例（91.4%）的病人发生了术后复发，63例发现肝内复发灶，4例发生肺转移，1例侵袭腹腔。在确定发生肝内转移后，31个患者接受了TACE术，9例接受的再次切除。一个患者接受了RFA术。9例再次切除的患者中，7例切除标本可供我们评估，其中3例诊断为肝细胞癌伴胆管上皮分化，一例为肝细胞癌，2例为肝内胆管癌以及一例完全坏死。2.癌旁胆管反应的观察80例病例的癌旁组织均可见不同程度增强的胆管反应（K7染色，K7-DR）。其中5例1+(≤10%)，11例2+(10%to25%)，22例3+(26%to50%),42例4+(≥50%)。PI-DR在26.3%的病例中表现出≥50%，即过半的RDCs处于细胞周期中，提示处于高度的增殖状态，该部分RDCs在形态上与低增殖状态的RDCs并无明显形态学上的差异。3.癌旁胆管反应与转化增殖肝祖细胞关系密切我们观察到部分K7-DR4+病理却表现出较低的增殖水平。在群体水平，K7-DR跟PI-DR没有观察到统计学的相关性（r=0.074, P=0.512）。这些数据提示DR的增殖水平可能更好地反映祖细胞的转化增殖状态。在近汇管区，表达OV-6或EpCAM的中间型肝细胞可以被观察到与RDCs相连接。高PI-DR，而不是高K7-DR的病例，具备更多的中间型肝细胞-胆管细胞（r=0.506, P<0.001）以及更高的肝细胞OV-6表达水平（r=0.514, P<0.001）肝实质OV-6表达和PI-DR呈强烈正相关。所以，我们认为PI-DR可以更好地代表癌旁祖细胞的激活状态。我们进一步分析PI-DR与其他临床病理资料的相关性。我们发现PI-DR与患者手术时的年龄，肝纤维化水平以及肝细胞的增殖抑制程度呈独立相关性。4. PI-DR与术后无瘤生存率具有相关性我们进一步分析了根治切除病人中（n=70）上述祖细胞相关特征和患者临床预后间的相关性。在患者总体生存（overall survival, OS）的分析中，单因素分析发现患者OS与多种因素有关。包括PI-DR、K7-DR、肝细胞癌组分的“多中心发生”特征、AFP在肿瘤中的表达，以及微血管侵犯（MVI）和TNM分期。将这6个变量选入进行下一步多因素分析，发现：PI-DR、K7-DR、MO、AFP在肿瘤中的表达均为总体生存的独立预后因素。而在无瘤生存分析中，与总体生存不同，单因素分析发现：HAI炎症评分、NLR、PI-DR、MO以及MVI与复发存在显著的相关性（p<0.050）。而多发肿瘤、血清AFP升高未达到统计学差异（p<0.10）。将这7个变量入选进行下一步多因素分析发现仅MVI和PI-DR是患者无瘤生存的独立影响因素。5.祖细胞介导的癌旁肝再生模式具有较高的复发风险在中间型肝细胞的免疫荧光双标记的观察中，我们发现OV-6和AFP在中间型肝细胞的共定位表达十分少见。OV-6和AFP的表达呈现“此消彼长”的趋势。采用计算机辅助方法评估肝实质细胞OV-6和AFP表达后证实OV-6和AFP的表达呈负相关。前面已经证明肝实质OV-6表达和PI-DR呈强烈正相关，进一步分析发现AFP的表达与PI-DR呈负相关，提示此二者的表达情况的变化可能反映出祖细胞增殖分化甚至逆向分化的体内过程。并且在K7-DR4+的病例中，此二者的负相关显得更加强烈，考虑到AFP是成熟肝细胞去分化的标志物，提示该过程可能与DR的异质性有关系。以OV-6表达和AFP表达区分的肝脏再生状态的同样与术后复发关系密切。6.“场效应”的扩展：PI-DR与混合型肝细胞-胆管细胞癌肿瘤内多种祖细胞标志物的表达存在联系PI-DR与混合型肝细胞-胆管细胞癌肿瘤内多种祖细胞标志物的表达存在联系，如K7(r=0.232, P=0.038)，EpCAM (r=0.239, P=0.033)，OV-6(r=0.480,P<0.001)，c-Kit(r=0.392, P<0.001)，另外与肿瘤内HPC样肿瘤细胞也存在相关性(r=0.232, P=0.039)。7.混合型肝细胞-胆管细胞癌“多中心发生”特征与癌旁祖细胞激活关系密切多中心发生特征与肿瘤/肿瘤旁特征存在相关性。与癌旁PI-DR（p=0.008）以及OV-6表达（p=0.001）的相关性说明多中心发生可能与癌旁的祖细胞激活存在相关性。另外，我们发现多中心发生与肝纤维化程度存在相关性（p=0.002），但并没有发现其与炎症评分的显著相关性（p=0.616）。肿瘤方面，我们发现具备多中心发生特征的病例有更高的OV-6肿瘤表达，同时体积更小。【结论】所有的结果显示：1.混合型肝细胞-胆管细胞癌具备显著的肿瘤异质性，提示可能为肝祖细胞起源。2.在复杂的肝脏疾病演进过程中，与肝脏的修复方式密切相关的多样化的胆管反应可共存于同一基础肝脏疾病情况下。胆管反应的增殖状态可以部分区分代表肝祖细胞转化增殖的异质性表型。3.胆管反应的增殖状态可以预测混合型肝细胞-胆管细胞癌的术后复发。以肝实质修复为目的的祖细胞激活可能是混合型肝细胞-胆管细胞癌的重要驱动力。4.胆管反应的增殖状态与肿瘤内异质性（肿瘤分化和表型）存在密切联系，扩展了“场效应”的范围。混合型肝细胞-胆管细胞癌的复发不仅与肿瘤较强的侵袭能力有关，也与癌旁转化增殖的祖细胞相关的“场效应”有关。5.胆管反应的增殖状态与混合型肝细胞-胆管细胞癌肿瘤内“多中心发生”特征呈独立相关性，提示癌旁祖细胞增殖可能参与了多中心癌变过程。