重组甘氨酸-胸腺素β4生产工艺研究

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心肌梗塞现已成为严重危害人类健康的疾病。目前临床上的治疗药物和方法很多,但还存在着相当大的问题,尤其是尚缺乏提高心肌耐缺血能力和促进心肌细胞修复的药物和方法。已有研究表明,胸腺素β4(简称Tβ4)有助于预防与修复缺血性心脏病发作后的心脏损伤,可用于心肌缺血性损伤的治疗。要将Tβ4成功开发成为治疗心肌梗塞的药物,制备工艺和质量标准的建立是至关重要的,本论文针对重组甘氨酸-胸腺素β4(简称Gly-Tβ4)的制备工艺、质量标准和药效学试验进行了研究。主要研究内容如下:1.研究了摇瓶条件下工程菌的生长和诱导条件,得到了优化的摇瓶培养条件;研究了工程菌在30L发酵罐的生长和诱导条件,得到了优化的发酵条件,使目的融合蛋白得到了高效表达。2.研究了重组Gly-Tβ4小试纯化工艺的建立,包括使用镍离子金属螯合层析纯化目的融合蛋白,凝胶过滤层析去除咪唑,使用凝血酶对目的融合蛋白进行酶切释放目的蛋白,阴离子交换层析对酶切后的目的蛋白进行初步纯化,反相层析对目的蛋白进行精纯化以及去除内毒素,阴离子交换层析对反相层析引入的有机溶剂进行去除并浓缩目的蛋白;小试纯化工艺方法初步建立后,又进行了工艺条件的优化,包括镍离子金属螯合层析上样液咪唑加入浓度的研究,凝血酶酶切条件的研究和反相层析洗脱条件的研究。经过多批纯化证明了小试纯化工艺的稳定性。3.研究了重组Gly-Tβ4中试纯化工艺的建立,主要通过对小试纯化工艺的线性放大,基本按照层析柱直径增大、层析介质高不变、线性流速不变的原则进行放大,建立了中试纯化工艺,经过多批纯化证明了中试纯化工艺的稳定性。4.研究了重组Gly-Tβ4质量标准的建立,重点研究并优化了使用反相高效液相色谱分析Gly-Tβ4纯度的方法,以及E-玫瑰花结法测定Gly-Tβ4生物学活性的方法,建立了完整的Gly-Tβ4原液和成品的质量标准。5.进行了重组Gly-Tβ4的药效学研究,使用大鼠心肌梗塞模型进行了体内生物活性评价研究,结果表明,Gly-Tβ4对大鼠冠脉结扎造成的心肌梗塞有治疗效果。
摘要第3-4页
ABSTRACT第4-5页
第一章 文献综述第10-29页
    1.1 心肌梗塞疾病研究概述第10-13页
        1.1.1 心肌梗塞疾病的危害第10页
        1.1.2 心肌梗塞疾病的分类和症状第10-12页
        1.1.3 心肌梗塞治疗的药物及方法现状第12-13页
    1.2 胸腺素β4 研究概述第13-22页
        1.2.1 胸腺素β4 介绍第13页
        1.2.2 天然胸腺素β4 化学结构第13-14页
        1.2.3 生物学分布及表达情况第14页
        1.2.4 Tβ4 生物学功能第14-17页
        1.2.5 Tβ4 药物国内外研发进展第17-20页
        1.2.6 Tβ4 药物开发展望和市场前景第20-22页
    1.3 应用Tβ4 治疗心肌梗塞疾病的研究进展第22-23页
        1.3.1 动物试验研究第22-23页
        1.3.2 RegeneRX 公司进行的临床试验第23页
    1.4 Tβ4 的制备工艺和质量标准研究进展第23-27页
        1.4.1 Tβ4 制备工艺研究进展第23-26页
        1.4.2 Tβ4 质量标准研究进展第26-27页
    1.5 本论文的选题思路及主要研究内容第27-29页
第二章 摇床工艺研究第29-35页
    2.1 引言第29页
    2.2 材料与方法第29-32页
        2.2.1 试剂第29-30页
        2.2.2 实验仪器第30页
        2.2.3 试验方法第30-32页
    2.3 结果与讨论第32-34页
        2.3.1 不同培养基对细菌生长及蛋白表达的影响第32-33页
        2.3.2 诱导时间对细菌生长及蛋白表达的影响第33-34页
        2.3.3 诱导温度对细菌生长及蛋白表达的影响第34页
    2.4 小结第34-35页
第三章 发酵工艺研究第35-52页
    3.1 引言第35页
    3.2 材料和方法第35-38页
        3.2.1 试剂第35-36页
        3.2.2 仪器第36页
        3.2.3 实验方法第36-38页
    3.3 结果与讨论第38-50页
        3.3.1 菌体在不同组分培养基中培养和表达第38-44页
        3.3.2 接种量对发酵的影响第44-48页
        3.3.3 诱导时间对发酵的影响第48-50页
    3.4 小结第50-52页
第四章 小试纯化工艺研究第52-69页
    4.1 引言第52-53页
    4.2 材料与方法第53-58页
        4.2.1 试剂第53-54页
        4.2.2 仪器第54-55页
        4.2.3 主要耗材第55页
        4.2.4 实验方法第55-58页
        4.2.5 工艺优化研究第58页
        4.2.6 小试纯化工艺的稳定性研究第58页
    4.3 结果与讨论第58-68页
        4.3.1 小试纯化工艺的结果与讨论第58-66页
        4.3.2 工艺优化研究的结果和讨论第66-68页
        4.3.3 小试纯化工艺的稳定性研究结果与讨论第68页
    4.4 小结第68-69页
第五章 中试纯化工艺研究第69-80页
    5.1 引言第69页
    5.2 材料和方法第69-73页
        5.2.1 试剂第69页
        5.2.2 仪器第69-70页
        5.2.3 耗材第70-71页
        5.2.4 实验方法第71-73页
        5.2.5 中试纯化工艺的稳定性研究第73页
        5.2.6 成品的制备第73页
    5.3 结果与讨论第73-79页
        5.3.1 破菌和澄清的结果和讨论第73页
        5.3.2 层析一、层析二和酶切的结果和讨论第73-76页
        5.3.3 层析三、四、五的结果和讨论第76-78页
        5.3.4 纯化工艺的稳定性第78-79页
        5.3.5 成品的制备研究第79页
    5.4 小结第79-80页
第六章 质量标准研究第80-94页
    6.1 前言第80页
    6.2 材料和方法第80-85页
        6.2.1 主要试剂第80-81页
        6.2.2 主要仪器第81页
        6.2.3 方法第81-85页
    6.3 结果与讨论第85-93页
        6.3.1 HPLC 纯度第85-87页
        6.3.2 生物学活性第87-92页
        6.3.3 质量标准的建立第92-93页
    6.4 小结第93-94页
        6.4.1 HPLC 纯度测定第93页
        6.4.2 生物活性测定第93页
        6.4.3 质量标准的建立第93-94页
第七章 大鼠心肌梗塞疾病模型治疗效果研究第94-103页
    7.1 引言第94页
    7.2 材料和方法第94-97页
        7.2.1 试验试剂和试验动物第94-95页
        7.2.2 试验仪器第95页
        7.2.3 试验方法第95-97页
    7.3 试验结果第97-102页
        7.3.1 对左室功能的影响第97-99页
        7.3.2 对左室构型的影响第99-100页
        7.3.3 对血流动力学参数的影响第100页
        7.3.4 对心肌梗塞范围的影响第100页
        7.3.5 对肺水肿的影响第100-101页
        7.3.6 对心肌肥厚的影响第101页
        7.3.7 对心肌酶活性的影响第101页
        7.3.8 对心肌I/III 型胶原的影响第101-102页
    7.4 小结第102-103页
第八章 结论与展望第103-106页
    8.1 结论第103-104页
    8.2 创新点第104-105页
    8.3 展望第105-106页
参考文献第106-112页
发表论文和参加科研情况说明第112-114页
致谢第114页
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