肝细胞癌血管生成拟态的临床意义及分子机制研究

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研究目的1.研究基质型血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)(简称肝癌)中表达,结合临床病理及随访资料加以分析,探讨VM在肝癌中表达的临床意义。2.研究不同转移潜能人肝癌细胞株HCCLM3、MHCC97-H和MHCC97-L(转移潜能由高到低)体内、外形成VM的差异,并利用血管生成、细胞外基质与粘连分子基因芯片筛选细胞间差异表达的基因,以探索VM血管生成及细胞外基质相关机制。3.探讨两种基因芯片所筛选差异表达基因之血管生成相关基因Jagged 1和细胞外基质相关基因骨桥蛋白(osteopontin, OPN)在肝癌VM形成中的作用。研究方法1.收集临床病理资料完整的151例肝癌组织标本,采用层粘连蛋白、CD34和Hepatocyte免疫组织化学染色以及透射电镜技术检测肝癌组织中基质型VM表达,并分析其与肝癌临床病理指标及生存预后的关系。2.建立HCCLM3、MHCC97-H、MHCC97-L三维培养体系,倒置显微镜及过碘酸席夫染色观察体外VM形成差异。建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,研究HCCLM3、MHCC97-L体内形成VM的差异。三维培养24 h后,应用Oligo血管生成、细胞外基质与粘连分子基因芯片筛选MHCC97-H和MHCC97-L中差异表达的基因,并采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-Blot验证部分差异表达的基因;应用血管生成、细胞外基质与粘连分子Real-time PCR芯片对HCCLM3和MHCC97-L进行差异表达基因筛选。3.应用RNA干扰技术干扰Jagged 1和OPN表达,Real-time PCR、Western-Blot及免疫荧光方法检测干扰效果;三维培养观察干扰后肝癌细胞株MHCC97-H VM形成变化;免疫组织化学方法检测Jagged 1和OPN在肝癌组织中的表达,并分析其与VM在肝癌组织中的表达相关性。研究结果1.151例肝癌组织中基质型VM阳性31例。组织中基质型VM阳性肝癌患者相比阴性患者,肿瘤较大,血管侵犯率高,Edmondson分级高,pTNM分期晚。基质型VM阳性患者和基质型VM阴性患者1、3、5年总生存率分别为67.7%、34.6%、11.5%和86.7%、64.7%、40.3%(P<0.001)。单、多因素分析显示,多发肿瘤、血管侵犯和基质型VM表达是影响总生存率的独立危险因素。2.三维培养24h, HCCLM3、MHCC97-H、MHCC97-L及HUVECs均形成血管样结构,HCCLM3、MHCC97-H MHCC97-L形成的血管样结构长度逐渐缩短。裸鼠皮下移植瘤组织中,HCCLM3形成VM阳性率高于MHCC97-L.在Oligo基因芯片筛选出的6个差异表达的血管生成相关基因中,MHCC97-H表达较MHCC97-L上调的有4个,下调的有2个。在Oligo基因芯片筛选出的10个差异表达的细胞外基质与粘连分子相关基因中,MHCC97-H表达较MHCC97-L上调的有7个,下调的有3个。部分差异表达的基因RT-PCR与Western-Blot验证结果与基因芯片结果一致。在Real-time PCR芯片筛选出的21个差异表达的血管生成相关基因中,11个基因在HCCLM3中表达较MHCC97-L明显上调,10个基因明显下调。在Real-time PCR芯片筛选出的20个差异表达的细胞外基质与粘连分子相关基因中,13个基因在HCCLM3中表达较MHCC97-L明显上调,7个基因明显下调。Oligo基因芯片所筛选出的差异表达基因与Real-time PCR芯片变化趋势一致,3.应用RNA干扰技术干扰Jagged 1和OPN后,Real-time PCR、Western-Blot和免疫荧光方法所测基因及蛋白表达水平明显下降;三维培养条件下,干扰后的MHCC97-H不能形成明显的血管样结构;免疫组织化学检测显示Jagged 1和OPN表达于肝癌胞浆中,肝癌组织中Jagged 1和OPN表达与VM成正相关关系。研究结论1.人肝细胞癌中存在基质型VM,其表达与肿瘤大小、分级、分期、血管侵犯有关,是影响肝癌患者预后不利的独立危险因素。2.高转移人肝癌细胞株体内、外形成VM能力明显较低转移人肝癌细胞株强,其原因可能与高转移人肝癌细胞株差异表达某些血管生成或细胞外基质与粘连分子相关基因有关。3.差异表达的基因——血管生成相关基因Jagged 1与细胞外基质相关基因OPN可能是肝癌VM形成的关键调节基因,在VM形成过程中起着重要的促进作用。
中文摘要第4-6页
Abstract第6-8页
符号说明第12-13页
前言第13-16页
    研究现状、成果第13-14页
    研究目的、方法第14-16页
一、肝癌血管生成拟态的临床研究第16-27页
    1.1 对象和方法第16-19页
        1.1.1 研究对象第16页
        1.1.2 主要试剂与材料第16-17页
        1.1.3 主要仪器设备第17页
        1.1.4 实验方法第17-18页
        1.1.5 统计学分析第18-19页
    1.2 结果第19-24页
        1.2.1 免疫组织化学染色检测肝癌组织中VM表达第19-20页
        1.2.2 透射电镜观察第20页
        1.2.3 VM与临床病理资料之间的关系第20-22页
        1.2.4 VM与肝癌患者生存预后的关系第22页
        1.2.5 影响生存预后的单、多因素分析第22-24页
    1.3 讨论第24-26页
        1.3.1 血管生成拟态的概念第24页
        1.3.2 血管生成拟态的临床意义第24-25页
        1.3.3 肝癌血管生成拟态研究第25-26页
    1.4 小结第26-27页
二、人肝癌细胞株血管生成拟态研究及基因芯片筛选第27-63页
    2.1 对象和方法第27-45页
        2.1.1 实验材料第27-29页
        2.1.2 主要仪器设备第29页
        2.1.3 实验方法第29-45页
        2.1.4 统计学分析第45页
    2.2 结果第45-57页
        2.2.1 细胞三维培养观察第45-46页
        2.2.2 过碘酸席夫(PAS)染色第46-47页
        2.2.3 裸鼠肝癌皮下移植瘤组织中VM检测第47-49页
        2.2.4 裸鼠肝癌皮下移植瘤组织中VM电镜观察第49页
        2.2.5 Oligo血管生成基因芯片检测结果第49-50页
        2.2.6 Oligo细胞外基质与粘连分子基因芯片检测结果第50-51页
        2.2.7 血管生成Real-time PCR芯片检测结果第51-53页
        2.2.8 细胞外基质与粘连分子Real-time PCR芯片检测结果第53-54页
        2.2.9 Oligo基因芯片检测结果RT-PCR验证结果第54-56页
        2.2.10 Oligo基因芯片检测结果Western-Blot验证结果第56-57页
    2.3 讨论第57-62页
        2.3.1 不同转移潜能人肝癌细胞株发生VM的差异第57页
        2.3.2 肿瘤细胞基因型向多潜能胚胎样表型逆转第57-60页
        2.3.3 血管生成拟态细胞外基质相关机制第60-62页
    2.4 小结第62-63页
三、siRNA干扰Jagged 1与OPN对血管生成拟态的影响第63-78页
    3.1 对象和方法第63-68页
        3.1.1 实验材料第63-64页
        3.1.2 主要仪器设备第64-65页
        3.1.3 实验方法第65-67页
        3.1.4 统计学分析第67-68页
    3.2 结果第68-74页
        3.2.1 Jagged 1基因干扰结果第68页
        3.2.2 OPN基因干扰结果第68-69页
        3.2.3 Jagged 1抑制对VM形成的影响第69-70页
        3.2.4 OPN抑制对VM形成的影响第70-71页
        3.2.5 Jagged 1与VM在肝癌组织中的表达相关性第71-72页
        3.2.6 OPN与VM在肝癌组织中的表达相关性第72-74页
    3.3 讨论第74-77页
        3.3.1 Jagged 1在肿瘤中表达及意义第74页
        3.3.2 Jagged 1对血管生成的影响第74-75页
        3.3.3 OPN在肿瘤中表达及意义第75-76页
        3.3.4 OPN对血管生成及血管生成拟态的影响第76-77页
    3.4 小结第77-78页
结论第78-79页
论文创新点第79-80页
参考文献第80-91页
发表论文和参加科研情况说明第91-93页
综述 肿瘤血管生成拟态研究进展第93-109页
    综述参考文献第102-109页
致谢第109页
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